綠原酸調控內質網應激PERK-CHOP通路對安氟烷誘導大鼠肝毒性的保護作用

張思思 蔡英敏 王武濤 喬艷

鹵代吸入麻醉劑是目前被廣泛應用于全身麻醉的一種藥物,但其對肝臟有不同程度的損傷[1]。安氟烷是鹵代吸入麻醉劑中的一種,產生作用緩慢,常與其他藥物一起誘導麻醉,盡管其肝毒性較低于氟烷,但依然能夠在術后引起急性肝損傷[2]。因此,深入研究術后麻醉劑誘導的肝損傷機制及其預防途徑是必要的。綠原酸(Chlorogenic acid,CGA)是一種多酚,多存在與咖啡、山楂、山藥、金銀花等物質中,具有抗炎、抗菌、抗癌以及神經保護等多種作用[3]。研究已經證實,CGA能夠減輕他莫昔芬介導的肝腎損傷,同時也可以通過抑制內質網應激減輕腎損傷[4,5]。內質網(ER)應激是由ER內積累的未折疊或錯誤折疊蛋白激活的未折疊蛋白反應(UPR)。蛋白激酶RNA樣ER激酶(PERK)是介導UPR的信號通路的上游因子之一,其磷酸化能夠誘導下游真核翻譯起始因子2α(eIF2α)磷酸化,激活促凋亡轉錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達,促進細胞凋亡[6]。目前已經發現,通過抑制ER應激可以降低肝細胞中的炎性體活化改善肝損傷,也可以降低細胞凋亡率減輕藥物誘導的肝損傷[7]。因此,基于上述了解,本研究利用安氟烷誘導大鼠產生肝損傷,探討CGA保護大鼠肝毒性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠60只,8周齡體重160～200 g,購于卡文斯百格(蘇州)模式動物研究有限公司,許可證號：SCXK(蘇)2018-0002。大鼠均在溫度24～26℃,濕度60%的環境中適應性飼養3 d。

1.2 藥品及試劑 安氟烷(上海雅培制藥有限公司);PERK激活劑CCT020312(CCT,貨號：HY-119240,MedChemExpress);天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(貨號：EK-R38215、EK-R37339、EK-R37579,上海酶研生物科技有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號：G1120,北京索萊寶科技有限公司);TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：40307ES20,翌圣生物科技股份有限公司);BCA檢測試劑盒(貨號：JLC-G7687,江西江藍純生物試劑有限公司);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(貨號：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005,北京索萊寶科技有限公司);PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP一抗(貨號：ab79483、ab192591、ab169528、ab227593、ab11419,英國Abcam公司);山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP(貨號：GARG80-0500、AS16-3715,艾美捷科技有限公司);BCL2、BAX(貨號：ab32124、ab32503,英國Abcam公司);酶標儀(型號：ELx808,美國Bio-Tek公司);倒置熒光顯微鏡(型號：IX83,儀景通光學科技有限公司);iBright凝膠成像儀(型號：CL750,賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠分組、造模和給藥：將所有大鼠隨機分為對照組、模型組、CGA低劑量組、CGA高劑量組、CGA高劑量+PERK激活劑組(CGA-H+CCT組),每組12只。除對照組外,其他組均以2 L/min的流量吸入1.7%的安氟烷4 h[8];對照組相同條件吸入等量的氧氣;CGA低、高劑量組在吸入安氟烷1 h前分別以10 mg/kg、50 mg/kg的劑量開始灌胃給藥[9];CGA-H+CCT組先腹腔注射1 mg/kg的PERK激活劑CCT020312[10],再灌胃50 mg/kg的CGA;對照組和模型組均灌胃等體積的純凈水。2次/d,持續5 d。

1.3.2 檢測大鼠血清中肝功能指標AST、ALT、ALP的活性：所有大鼠在實驗結束后進行尾靜脈采血5 ml,3 000×g,4℃離心15 min,收集上清并保存于-20℃,備用。試劑盒檢測大鼠血清AST、ALT、ALP的活性。

1.3.3 檢測血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平：按照TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA檢測試劑盒的步驟制作標椎曲線,然后將血清分別與不同的生物素化抗體反應完全后,檢測450 nm處的OD值,再根據標準曲線計算TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度。

1.3.4 HE染色觀察大鼠肝組織的病理變化：采血結束后,所有大鼠用1%的戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)麻醉并處死,解剖并分離肝臟組織,部分(n=6)固定于4%多聚甲醛溶液中進行石蠟包埋并切片,剩余組織(n=6)保存于-80℃。將石蠟切片用二甲苯和乙醇浸泡脫蠟后,使用HE染色液進一步染色,并用PBS沖洗切片。光學顯微鏡下觀察肝組織的病理變化。

1.3.5 TUNEL染色檢測大鼠肝細胞凋亡：取1.3.4中的石蠟切片進行脫蠟、再水化,然后用蛋白酶K稀釋液孵育30 min。接著將切片置于50 μl準備好的TUNEL工作液中,37℃避光孵育1 h,再用DAPI在避光條件下復染10 min,最后用PBS洗滌并封片。熒光顯微鏡下觀察488 nm處細胞的凋亡情況。

1.3.6 Western blot檢測大鼠肝組織中ER應激蛋白PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP的表達：將1.3.4中凍存的組織(n=6)勻漿,制備蛋白樣品并測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白,并轉移至PVDF膜上。將PVDF膜用脫脂奶粉封閉液4℃過夜孵育,然后分別加入PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP一抗(PERK、eIF2α稀釋比例,為1∶500,p-PERK、p-eIF2α稀釋比例為1∶1 000,CHOP稀釋比列為1∶200)室溫孵育1 h。洗膜后分別加入羊抗兔或羊抗小鼠稀釋液(稀釋比例均為1∶5 000)室溫孵育1 h。洗膜后用ECL顯影劑顯影,用凝膠成像儀成像。以GAPDH為內參蛋白,利用Image J對目的蛋白進行定量分析。

1.3.7 免疫組化法檢測大鼠肝組織中BCL2、BAX蛋白水平 將1.3.4中石蠟切片脫蠟再水化,然后將切片放在封閉液中封閉2 h,再與BCL2、BAX一抗稀釋液(稀釋比例為1∶1 000)在4°C孵育過夜,PBS清洗后與羊抗兔二抗(稀釋比例均為1∶5 000)一起孵育1 h,PBS清洗后用DAB染色,蘇木素復染。使用Image J軟件分析并計算BCL2、BAX陽性表達區域光密度值。

2 結果

2.1 CGA對安氟烷誘導的大鼠血清中AST、ALT的影響 與對照組比較,模型組大鼠的血清中AST、ALT、ALP活性升高(P<0.05);與模型組比較s,CGA低、高劑量組血清中AST、ALT、ALP活性降低(P<0.05),且CGA高劑量組AST、ALT、ALP活性低于低劑量組(P<0.05);與CGA高劑量組比較,CGA-H+CCT組血清中AST、ALT、ALP活性升高(P<0.05)。見表1。

表1 CGA對大鼠血清中AST、ALT、ALP活性的影響 n=12,U/L,

2.2 CGA對安氟烷誘導的大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的影響 與假手術組比較,模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05);與模型組比較,CGA低、高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05),且CGA高劑量組炎性因子水平低于低劑量組(P<0.05);與CGA高劑量組比較,CGA-H+CCT組組TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 CGA對大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 n=12,pg/ml,

2.3 CGA對安氟烷誘導的大鼠肝組織病理形態的影響 與對照組相比,模型組大鼠肝細胞數量減少,排列不規則,且出現腫脹和空泡;與模型組相比,CGA低、高劑量組大鼠肝細胞數量增多且排列有序,有輕微腫脹,空泡減少;與CGA高劑量組相比,CGA-H+CCT組肝組織的病理損傷加重。見圖1。

對照組 模型組 CGA低劑量組 CGA高劑量組 CGA-H+CCT組

2.4 CGA對安氟烷誘導的大鼠肝細胞凋亡的影響 與對照組比較,模型組大鼠中肝細胞的凋亡率升高(P<0.05);與模型組比較,CGA低、高劑量組大鼠肝細胞的凋亡率降低(P<0.05),且CGA高劑量組凋亡率低于低劑量組(P<0.05);與CGA高劑量組比較,CGA-H+CCT組大鼠肝細胞的凋亡率升高(P<0.05)。見圖2,表3。

對照組 模型組 CGA低劑量組 CGA高劑量組 CGA-H+CCT組

表3 CGA對大鼠肝細胞凋亡的影響 n=6,%,

2.5 CGA對安氟烷誘導的大鼠肝組織中PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP蛋白的影響 與對照組比較,模型組大鼠肝組織中p-PERK、p-PERK/PERK、p-eIF2α、p-eIF2α/eIF2α、CHOP蛋白表達降低(P<0.05);與模型組比較,CGA低、高劑量組肝組織p-PERK、p-PERK/PERK、p-eIF2α、p-eIF2α/eIF2α、CHOP蛋白表達升高(P<0.05),且CGA高劑量組蛋白表達高于低劑量組(P<0.05);與CGA高劑量組比較s,CGA-H+CCT組肝組織中p-PERK、p-PERK/PERK、p-eIF2α、p-eIF2α/eIF2α、CHOP蛋白表達降低(P<0.05)。各組PERK、eIF2α蛋白無顯著變化(P>0.05)。見圖3、表4。

圖3 大鼠肝組織中ER應激通路相關蛋白的表達;A 對照組;B 模型組;C CGA低劑量組;D CGA高劑量組;E CGA-H+CCT組

表4 CGA對大鼠肝組織中ER應激通路相關蛋白表達量的影響 n=6,

2.6 CGA對安氟烷誘導的大鼠肝組織中BCL2、BAX蛋白的影響 與對照組比較,模型組大鼠肝組織中BCL2蛋白表達減少,BAX蛋白表達增加(P<0.05);與模型組比較,CGA低、高劑量組大鼠肝組織中BCL2蛋白表達增加,BAX蛋白表達減少(P<0.05);與CGA組比較,CGA-H+CCT組大鼠肝組織中BCL2蛋白表達減少,BAX蛋白表達增加,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4,表5。

對照組 模型組 CGA低劑量組 CGA高劑量組 CGA-H+CCT組

表5 CGA對安氟烷誘導的大鼠肝組織中BCL2、BAX蛋白表達的影響 n=6,光密度,

3 討論

肝臟是許多藥物代謝的重要場所,而藥物導致的肝毒性也是常見的死亡因素之一。因此,深入了解肝毒性的機制對預防藥物性肝損傷至關重要[11]。在常用的鹵代麻醉劑中,安氟烷被證明與氟烷一樣,能夠引起肝毒性,但發生率低于氟烷。安氟烷誘導的肝損傷特點與氟烷一致,即血清中肝酶的急性升高[2]。據了解,肝損傷機制的核心是氧化應激和炎性反應,而目前大多數藥用植物及其化學物質能夠產生抗炎、抗氧化的作用[12]。CGA便是其中一種多酚類物質,能夠通過間接抑制促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6來發揮抗炎作用[13]。本研究結果顯示,模型組大鼠血清中肝功能指標AST、ALT、ALP以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高,且HE染色觀察到肝細胞數量減少,排列不規則,且出現腫脹和空泡等。揭示了安氟烷成功誘導大鼠肝毒性損傷。當CGA給藥后,肝功能指標AST、ALT、ALP以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低,肝細胞數量增多且排列有序,有輕微腫脹,空泡減少。表明了CGA能夠減輕安氟烷誘導的肝毒性損傷,但其作用機制還未深入研究。

ER應激的主要反應是葡萄糖調節蛋白78(GRP78)通過與其跨膜受體解離而激活PERK、肌醇需要蛋白1(IRE-1)和激活轉錄因子6(ATF6)三個通路上游因子[14]。在ER應激發生后,PERK作為一種胞質激酶,能夠通過反式自磷酸化,促使eIF2α的磷酸化,從而減少蛋白質的翻譯[15]。CHOP可以調節多種凋亡相關基因的表達,包括BCL2蛋白家族的抗凋亡蛋白BCL2,以及促凋亡蛋白BAX[16]。本研究結果發現,模型組大鼠的肝細胞凋亡率升高,PERK和eIF2α的磷酸化水平、CHOP和BAX蛋白表達均升高,BCL2蛋白表達降低,推測ER應激條件下的細胞功能障礙和細胞死亡是安氟烷誘導的肝毒性損傷的病理因素,PERK信號通路的激活能夠觸發促凋亡信號,從而促進細胞凋亡[17]。本研究中,CGA組大鼠肝細胞凋亡率降低,PERK和eIF2α的磷酸化水平、CHOP和BAX蛋白表達均降低,BCL2蛋白表達升高。揭示了CGA能夠抑制安氟烷誘導的肝細胞凋亡,從而減輕肝毒性,其作用可能是通過抑制ER應激通路中PERK的磷酸化以及促凋亡轉錄因子CHOP的表達。進一步加入PERK的激活劑CCT發現,CCT消除了CGA對上述肝功能指標、炎性因子以及凋亡相關因子的作用。

綜上所述,CGA可能通過抑制ER應激PERK-CHOP通路來減輕安氟烷誘導的大鼠肝毒性。本研究為預防藥物肝毒性提供了新的研究思路和方法。但PERK通路還存在許多下游調節因子,因此,PERK-CHOP通路之間的具體作用機制以及相互作用還有待進一步的深入探索。