侵襲性垂體腺瘤中TNF-α IL-6及VEGF之間表達水平變化的相關性研究

劉思洋, 吳建龍, 梅 贊, 蘇 彬, 王學文 齊迎松, 李斌斌, 王婷婷, 張金利, 高繼剛

(1.河北省承德市中心醫(yī)院, 河北 承德 067000 2..承德護理職業(yè)學院, 河北 承德 067000)

垂體腺瘤約占全顱內腫瘤的15%,只比腦膜瘤與膠質瘤發(fā)病率低一些,是顱內腫瘤比較常見的類型之一[1]。垂體腺瘤有可能呈現(xiàn)有異常與無異常激素分泌,據(jù)此可劃分為非功能性垂體腺瘤與功能性垂體腺瘤,前者可表現(xiàn)為性功能低下、閉經、月經不調、肢端肥大等一系列內分泌方面的癥狀,后者無明顯內分泌增加的癥狀。垂體腺瘤大都不會對患者的生命造成威脅,屬于良性生物學行為表現(xiàn),但也有25%～55%呈侵襲性生長狀態(tài),對于這部分垂體腺瘤,我們稱之為侵襲性垂體腺瘤,(invasive pituitaryadenom IPA),IPA通過部分快速生長并侵入周邊組織而破壞下丘腦、鄰近硬膜、海綿竇等正常結構[2]。目前,針對于侵襲性垂體腺瘤而言,采取手術切除方法會起到良好療效,主要方法為經鼻蝶竇顯微鏡、內鏡手術。由于該疾病具有侵襲性生長的特點,所以采取手術切除腫瘤很容易留下病灶,這導致高復發(fā)率,患者預后不理想[3]。此外,考慮到侵襲性垂體腺瘤獨特的生長特點,手術過程中組織可能殘留,徹底切除不易,復發(fā)率高,加上放療效果也不太理想。近年來,許多學者將IPA治療的研究重點放在藥物開發(fā)上,副作用少、具有高藥效、特異性較強的靶向藥物就是其中之一,未來可能實現(xiàn)[4]。查閱相關文獻,TNF-α、對IL-6和VEGF在侵襲性垂體瘤中的研究也很多,為了能夠為IPA的靶向治療提供一定的理論基礎,重點研究了這三種因子在IPA中的表達。

1 資料與方法

1.1標本來源及處理:標本來源于2016年10月至2020年6月的垂體腺瘤標本,均由承德市中心醫(yī)院神經外科醫(yī)師在手術切除時所取得,所有患者內分泌檢查基本正常,臨床癥狀均未表現(xiàn)出各激素升高引起的表現(xiàn),部分患者有頭暈、頭痛癥狀,經過系統(tǒng)的病理學檢查,最終判定這些標本不屬于無功能性垂體腺瘤,Wilson-Hardy分為3～4級,術前顱MRI及術中發(fā)現(xiàn)腫瘤位于鞍底周圍、海綿竇等部位為侵襲性垂體腺瘤。在該標準中,分為無功能IPA 38例、非IPA 18例。標本取材后立即置于-80℃液氮罐內冷凍保存,其余標本用10%中性福爾馬林固定。

1.2實驗設備和試劑:一抗:TNF-α抗體、IL-6抗體、VEGF抗體(均為小鼠抗人多克隆抗體),抗體由美國Santa Crua生物技術公司生產,二抗:酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物,美國Roche公司生產,顯色系為DAB顯色系。TRIzol試劑盒由賽默飛生物技術公司生產,采購大連寶生物公司熒光實時定量PCR試劑盒。

1.3免疫組織化學方法:IPA和非IPA組織取材(厚2mm),標本取材后經乙醇梯度脫水、二甲苯等處理后,進行石蠟包埋,然后切片(厚3～4μm),干燥溫度60℃以下,持續(xù)1h,脫蠟76℃ 16min,修復100℃ 64min,一抗(1∶100的小鼠抗TNF-α、IL-6和VEGF抗體)在37℃孵育24min,蘇體素在37℃孵育8min,藍色在37℃恢復4min。陰性對照與陽性對照分別由PBS與陽性切片代替,細胞漿以棕色黃色為陽性。采用免疫組化半定量方法綜合判定陽性和陰性:借助顯微鏡觀察切片,觀察范圍集中于腫瘤細胞密集區(qū),采取隨機挑選方法選擇5個視野,結合陽性強度與陽性細胞術做強度評價表達:①0分:陽性細胞數(shù)不超過10%;1分:陽性細胞數(shù)10%～25%;2分:陽性細胞數(shù)25%～50%為2分;3分:陽性細胞數(shù)超過50%。②針對染色強度進行評分的標準為:零分代表無著色、一分代表淺棕黃色著色、兩分代表棕黃色著色、三分代表深棕黃色角色。判定結果需要將①與②進行綜合評定,陰性(-):0分、低表達(+):1～2分、中度表達(2+):3～4分、5～6分為高表達(3+)。

1.4實時定量PCR檢測方法:根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取組織中總RNA,倒轉復制成cDNA,進行cDNA擴增。反應體系合計20μL:TaqDNA聚合酶10μL、上下游引物各0.75μL,cDNA模板1.5μL,ddH2O 7μL。反應條件:預改性95℃30s、95℃5s、60℃30s、72℃30s延長,共40個循環(huán)。試劑盒可以選擇熒光定量PCR,檢查對象為內參基因與目的基因,TNF-α的正向引物序列為5-AAGCTCTGAGCCATTTGTAGGA-3′,反向引物序列為5′-GGGCAGACTTGCCCTTGAA-3′;VGEF正向引物序列為5’-AtGACTTTCTTGGATACA-3’,反向引物序列為5’-TACTCAGGATTTTCTTGT-3’;IL-6正向引物序列是5′-GGCCCTAAACAAGTCTA-3′,反向引物序列是5′-ATATATATCCATCCAGACGAAGCA-3′;β-actin的正向引物序列5’-TAGAGAGTCACTACTCGGCAAT-3’、反向引物序列5’-AAAGAAAGGATAACGCA-3’。測定各組基因相對表達量的方法為2-ΔΔCT法。

2 結 果

2.1免疫組織化學結果:TNF-α試驗組陽性表達率為66%(25/38),對照組為22%(4/18),兩組差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=7.352,P=0.007);IL-6在試驗組的陽性表達率為71%(27/38),對照組為28%(5/18),兩組差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=7.090,P=0.008);試驗組VEGF陽性表達率為61%(23/40),對照組為17%(3/18),兩組差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=7.789,P=0.005)。見圖1、表1。

圖1 免疫組織化學檢測TNF-α、IL-6及VEGF在IPA及NIPA中的表達(SPX200)①③⑤為三者在IPA中的表達呈陽性,②④⑥在NIPA中的表達呈陰性,其中①②為TNF-α,③④為IL-6,⑤⑥為VEGF

表1 IPA及NIPA中TNF-α IL-6 VEGF的表達情況n(%)

2.2實時定量PCR檢查結果: IPA中TNF-α mRNA含量明顯高于NIPA,差異有統(tǒng)計學意義(t=10.92,P<0.05);IPA中IL-6mRNA含量明顯高于NIPA,差異具有統(tǒng)計學意義(t=9.45,P<0.05);IPA中VEGF mRNA含量明顯高于NIPA,差異有統(tǒng)計學意義(t=11.21,P<0.05)。見圖2、表2。

表2 IPA及NIPA中TNF-α IL-6 VEGF mRNA水平表達結果

3 討 論

目前,侵襲性垂體腺瘤治療,主要選擇手術作為治療方法,這樣可以最大限度地消除占位效應,但術后也會發(fā)生很多腦脊液漏、尿崩等并發(fā)癥。通過實驗觀察TNF-α、IL-6和VEGF三項指標在侵襲性垂體腺瘤中的表達水平明顯高于無侵襲性垂體腺瘤,這也提示三項指標對侵襲性垂體腺瘤的發(fā)生和進展可能具有一定的推動作用。

TNF-α是一種小分子蛋白質,是單核細胞與巨噬細胞在活化過程中產生,無論是病理還是生理,如細胞免疫、腫瘤免疫、炎癥反應等,TNF-α都起著重要的作用[5]。腫瘤組織之所以會對病體進行侵襲,主要原因在于腫瘤血管的形成,TNF-α在IL-8蛋白表達方面起著推動作用。不僅可以加快腫瘤血管的生長,而且可以加速內皮細胞的增殖[6]。出現(xiàn)腫瘤血管后,在IL-8的作用下,血管內皮細胞發(fā)生明顯收縮,這就加大了血管內皮細胞間空隙,受此影響,腫瘤細胞侵襲能力得到提高。此外,TNF-α還可以增加內皮細胞與腫瘤細胞的粘附力,在這種粘附力的干擾下,腫瘤細胞大量附著在細胞外基質,促使垂體腺瘤細胞侵襲正常組織與器官的能力得到增強,從而促進了侵襲性垂體腺瘤的發(fā)生和進展。有研究表明,岡田酸與TNF-α作用具有相似性,比如在二者作用下,熱休克蛋白27與成纖維細胞波形蛋白將發(fā)生磷酸化,最后形成磷酸化蛋白,具有促進腫瘤細胞生長的效果,從刺激效應角度分析,TNF-α遠超于岡田酸,兩者都能引起DNA的損傷[7]。在垂體腺瘤發(fā)展為侵襲性垂體腺瘤的過程中,TNF-α其中可能起到了上述作用。目前,多項研究表明,感染引起的慢性炎癥與多個生物腫瘤的發(fā)生有一定的相關性,接近20%[8]。IL-6是臨床上常見的炎癥因子,對侵襲性垂體腺瘤的生長也有一定的作用,作為炎癥信號擴增的關鍵因子,細胞因子、絲氨酸蛋白酶、粘附分子等是其調節(jié)基因,腫瘤的侵襲轉移與這些調節(jié)基因相關。作為一種生長因子的IL-6具有多功能自分泌或旁分泌的特點,對腫瘤細胞起雙向調節(jié)作用,刺激增殖和抑制分化。腦組織內的垂體前葉濾泡星形細胞是產生IL-6的主要部位,在gp130家族中也是重要的信號蛋白之一。血液循環(huán)是IL-6作用于垂體組織的途徑之一,但并非唯一,由于垂體細胞也能釋放IL-6,其主要作用主要是抑制垂體細胞生長,減少激素分泌。此外,IL-6可以通過刺激血管生長促進腫瘤細胞增殖,可以延長腫瘤細胞生存時間,使得腫瘤細胞凋亡得到延緩,并且能夠令腫瘤細胞快速生長,進而出現(xiàn)遠處轉移和對化療藥物的耐藥性。目前抗腫瘤治療的方法很多,目前被公認最有效的方法則是抑制血管內皮生長因子(VEGF)的表達。在腫瘤發(fā)展期間,VEGF有推動作用,其作用主要表現(xiàn)在促進腫瘤血管生成、腫瘤細胞進展和浸潤[9]。腫瘤細胞生長和侵襲所需的新生血管生成到成熟的過程需要復雜的多信號和多因子傳遞,這也是腫瘤細胞生成乃至具有侵襲性的重要條件。最新研究結果表明,VEGF通過MAPK、PI3K/Akt等途徑誘發(fā)細胞內信號轉導產生作用,顯示激活細胞增殖的功能。本實驗表明,VEGF在IPA的表達與在NIPA的表達相比,前者明顯高于后者,這就意味著垂體腺瘤侵襲生長時, VEGF具有推動作用。

本實驗根據(jù)免疫組織化學及RT-PCR結果分析,與NIPA相比TNF-α、IL-6、VEGF在IPA組織中在分子、蛋白水平上含量較高,在垂體腺瘤呈現(xiàn)不斷侵襲的狀態(tài)下,這三者接起到促進作用,并為治療IPA提供一定靶點的理論依據(jù)。本文的研究采用少量標本,以單中心為主,為進行更深入的探究,這可能為侵襲性垂體腺瘤的新治療方法提供一定的理論基礎,后期將收集更多的樣本進行充填。