炎癥相關因子TLR4 NF-κB在特發性膜性腎病腎組織中的表達及臨床意義

劉程君, 潘 艷, 劉 磊, 陳衛東, 陳 暢, 常保超

(蚌埠醫學院第一附屬醫院腎內科, 安徽 蚌埠 233000)

特發性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)是腎病綜合征常見的病理類型,也是導致腎衰竭的主要原因。近年來,IMN的發病率顯著上升,逐漸成為成人常見的原發性腎小球疾病之一。其發病機制目前尚不十分明確,多數學者認為免疫介導和炎癥損傷在其發病過程中起主導作用,而且越來越多的研究顯示多種炎癥因子和免疫反應相互作用共同參與了腎病的發病機制,與腎臟疾病進展有著密切關系。炎癥反應的發生涉及多種信號通路,其中核轉錄因子-kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)途徑是人類腎臟疾病中重要激活靶點,多種致病因素激活Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)信號轉導通路,進而激活下游通路NF-κB途徑,引起腎小球免疫炎癥反應[1]。既往已有動物實驗研究顯示,TLR4、NF-κB在膜性腎病大鼠中高表達,通過抑制TLR4/NF-κB轉導通路可以減輕腎臟損傷,我們有理由相信炎癥因子TLR4、NF-κB在IMN患者腎臟組織病變過程中發揮同樣重要作用[2]。因此,本研究選取IMN患者進行腎組織炎癥因子TLR4、NF-κB水平表達,觀察炎癥在IMN中的表達,為IMN的發病機制及治療方案提供依據。

1 資料與方法

1.1研究對象及分組:研究對象選取2021年3月至2022年3月于蚌埠醫學院第一附屬醫院經腎活檢初次診斷為特發性膜性腎病的患者45例為特發性膜性腎病組(IMN組),平均年齡(50.40±7.77)歲,其中男性30例,女性15例。同期選取因腎挫傷、腎腫瘤或輸尿管腫瘤等行腎臟切除留取健康腎臟組織20例作為正常對照組(NC組),平均年齡(56.80±7.32)歲,其中男性12例,女性8例。同時根據病理結果Masson染色觀察腎小管-間質是否伴有纖維化,將IMN組分為IMN纖維化組29例,平均年齡(53.24±6.69),IMN無纖維化組16例(45.25±7.04)。主要納入標準:所有研究對象年齡均大于18歲,均排除近期合并感染、嚴重心臟疾病、肝臟疾病等,且未接受過糖皮質激素及免疫抑制劑治療;IMN組的患者需經我院腎活檢初次診斷為IMN,排除因腫瘤、糖尿病、高血壓、藥物、肥胖、自身免疫性疾病等其他繼發性膜性腎病的可能;對照組選取的腎組織經我院病理科證實為無腫瘤轉移的正常腎組織。此研究經蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準(倫理批號:[2020]第117號)。

1.2一般臨床資料及生化指標:收集所有研究對象的一般臨床資料,包括姓名、性別、年齡、住院號、病程及聯系方式等。所有受試者的生化指標均來自在我院行空腹抽取外周靜脈血所得,包括血清白蛋白(Alb)、甘油三酯(TG)、尿素氮(BUN)、高密度脂蛋白(HDL)等,并化驗24h尿蛋白定量(24h-Upro)。

1.3病理組織:IMN組患者的病理組織蠟塊從合肥金域醫學檢驗公司獲取,將由我院泌尿外科獲取的NC組腎組織制作成病理組織蠟塊,分別將包埋在蠟塊中的腎組織標本取3μm厚度切片。

1.4主要試劑:兔抗P-NF-kB p65多克隆抗體(貨號GB113882,稀釋比例為1∶300),兔抗TLR4多克隆抗體(貨號GB11519,稀釋比例為:1∶300)。上述抗體均購于武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.5組織染色:將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min、無水乙醇Ⅰ5min、無水乙醇Ⅱ5min、75%酒精5min,流水反復沖洗幾遍,脫蠟至水。分別進行HE、Masson染色,光鏡下觀察各組腎臟組織病理變化。

1.6免疫組化染色:將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min、二甲苯Ⅲ20min、無水乙醇Ⅰ5min、無水乙醇Ⅱ5min、85%酒精5min、75%酒精5min,流水反復沖洗幾遍,脫蠟至水后,置于檸檬酸抗原修復緩沖液(PH6.0)中進行抗原修復,阻斷內源性過氧化物酶,然后于室溫下進行血清封閉30min,依次在PBS中滴加按一定比例配好的一抗、二抗,DAB顯色,蘇木素復染細胞核,脫水封片,顯微鏡鏡檢,最后進行圖像采集分析。蘇木素染細胞核為藍色,DAB顯出的陽性表達為棕黃色。腎組織免疫組化中棕黃色染色為炎癥因子陽性表達,棕黃色著色越深,炎癥因子表達越高。每張切片在高倍鏡(×400)下隨機選取10個視野,用Image J圖像分析軟件測得每個視野的平均光密度值,并以其10個視野的平均光密度值的均值反映炎癥因子陽性表達的強度,均值越大,陽性表達越強。

2 結 果

2.1IMN組與NC組病理組織學檢查:在光鏡下HE染色及Masson染色顯示,IMN組患者腎組織具有腎小球形態不規則彌漫性病變,毛細血管袢基底膜上皮下嗜復紅物沉積,系膜細胞及基質增生,腎小管上皮細胞空泡及顆粒樣變性,腎間質水腫伴有炎性細胞浸潤等特征。結果見圖1。

圖1 兩組腎組織病理染色結果(×400)注:圖A、圖B分別為特發性膜性腎病組腎組織行HE染色、Masson染色的顯微鏡下圖片;圖C、圖D分別為正常對照組腎組織行HE染色、Masson染色的顯微鏡下圖片

2.2IMN組及NC組腎組織炎癥因子的表達:腎組織免疫組化中棕黃色為炎癥因子的陽性表達,顯微鏡下顯示IMN組與NC組腎組織中有不同程度的炎癥表達,IMN組中的腎小管及腎小球細胞中存在的炎癥因子TLR4、NF-κB的陽性表達量明顯高于對照組。利用Image J圖像分析軟件測得10個視野的平均光密度值,并取其均值進行分析統計,結果顯示IMN組腎組織的炎癥因子TLR4(t=10.83,P<0.01)、NF-κB(t=9.80,P<0.01)表達圖像的平均光密度值顯著升高,炎癥表達明顯增強,與NC組比較明顯差異,具有統計學意義。IMN纖維化組TLR4、NF-κB的陽性表達的平均光密度值明顯高于無纖維化組(t=2.09,P<0.05)、(t=3.15,P<0.05),具有統計學意義,詳見表1、圖2及圖3。

表1 各組腎組織中TLR4 NF-κB平均光密度值比較

圖2 兩組TLR4、NF-κB的表達水平

圖3 三組腎組織免疫組化染色結果注:圖a、b分別為IMN纖維化組,圖c、d分別為IMN無纖維化組,圖e、f分別為NC組等腎組織切片行免疫組化檢測TLR4、NF-κB在顯微鏡下所采集的圖片

2.3腎組織炎癥相關因子的表達與臨床指標的相關性分析:相關分析結果提示,TLR4表達水平與血清白蛋白(r=-0.544,P<0.01)、高密度脂蛋白(r=-0.463,P<0.01)呈負相關,與24h尿蛋白定量(r=0.308,P<0.05)、血清膽固醇(r=0.485,P<0.01)、低密度脂蛋白(r=0.433,P<0.01)呈正相關。NF-κB表達水平與血清白蛋白(r=-0.307,P<0.05)、高密度脂蛋白(r=-0.334,P<0.05)呈負相關,與24h尿蛋白定量(r=0.319,P<0.05)呈正相關。TLR4、NF-κB表達水平與血清肌酐、尿酸、尿素氮均無相關性(P>0.05)。詳見表2。

表2 TLR4 NF-κB平均光密度值與各臨床指標的相關性分析

2.4TLR4、NF-κB相關性分析:相關分析結果示,腎組織中TLR4的表達與NF-κB的表達兩者之間呈正相關,相關系數r=0.476,差異有統計學意義(P<0.01)。結果見表3。

表3 TLR4 NF-κB的相關性分析

3 討 論

近些年來,越來越多的研究顯示炎癥因素在IMN的發病過程中起到重要作用。炎癥是疾病發展過程中的重要病理反應,它可以發生在各種類型的疾病中,各種炎癥因子之間相互作用介導的腎損傷而產生的蛋白尿是膜性腎病發病機制中的重要一環,在慢性腎臟病的發生、發展中扮演著重要角色[3]。因此,分析炎癥因子在IMN表達顯得極為重要。

Toll樣受體是先天性免疫受體,會對機體內源性危險因素進行反應,并促進機體進行免疫和炎癥反應,其中TLR4是腎臟炎癥的重要介質,主要表達于腎小管上皮細胞、系膜細胞,同時作為信號通路的啟動因子,激活腫瘤壞死因子、NF-κB等多個下游通路,進而激活多種炎癥介質的釋放引起腎臟纖維化,導致腎臟結構及功能改變。已有研究報道,在膜性腎病患者的腎組織中,TLR4表達上調,血管緊張素Ⅱ通過提高TLR4表達而促進足細胞凋亡,引起腎損傷[4]。Mertowski[5]等研究顯示Toll樣受體作為腎臟疾病潛在的生物標志物,TLR4的基因表達在對照組及IMN組患者中存在明顯差異,其與IMN發病過程密切相關。本實驗通過免疫組化方法對IMN患者腎組織中TLR4水平的檢測發現IMN組TLR4表達水平上調,而NC組TLR4低水平表達,結果與既往研究相符。在此基礎上,進一步做了TLR4與臨床資料進行Pearson相關性分析,結果顯示TLR4與血清白蛋白、高密度脂蛋白呈負相關,與24h尿蛋白定量、血清膽固醇、低密度脂蛋白呈正相關。因此我們考慮可以通過多種途徑來干預TLR4的表達,減輕腎臟炎癥反應,改善腎病患者臨床癥狀。蔡莉[6]等研究通過miR-25-3p靶向抑制TLR4轉錄和翻譯,進而抑制促炎性因子的轉錄,改善糖尿病腎病炎癥反應。也有研究報道,可以通過抑制TLR4/MyD88、TLR4/NF-κB等信號通路來干預TLR4的表達,從而改善腎臟纖維化,延緩疾病進展。結合本實驗研究結果,炎癥因子TLR4與IMN密切相關,參與了IMN的發病過程。

NF-κB廣泛存在于腎小管上皮細胞和系膜細胞中,為炎癥反應的下游信號通路,在細胞損傷和腎臟纖維化中起到重要作用[7]。多種外界因素刺激下,如氧化應激、炎癥反應等,可導致細胞中NF-κB激活,促進白細胞介素-6(IL-6)、巨噬細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子的釋放,對腎臟足細胞、系膜細胞造成炎性損傷,導致腎組織纖維化和蛋白尿等,嚴重者引起腎衰竭[8]。樊紅衛[9]等研究指出NF-κB在膜性腎病大鼠中表達上調,川芎嗪可以使NF-κB p65失活從而抑制炎癥反應,改善腎臟損傷。本研究結果顯示,NC組NF-κB低水平表達,IMN組NF-κB表達水平上調,炎癥表達明顯增強。同時進行Pearson相關分析提示NF-κB表達水平與血清白蛋白、高密度脂蛋白呈負相關,與24h尿蛋白定量呈正相關,這提示了NF-κB在IMN疾病發生、發展中扮演重要角色。Chebotareva[10]等研究也發現,在慢性腎小球腎炎患者中,NF-κB的表達水平與蛋白尿密切相關,這與本實驗研究相符,因此我們可以設想通過阻斷NF-κB信號通路的表達,減少蛋白尿,保護腎功能。

此外本研究發現,炎癥因子TLR4、NF-κB在IMN腎組織中不僅表達水平升高,且相關性分析顯示兩者間呈正比,表明其在炎癥過程相互作用和相互影響,從而認為機體可能通過激活TLR4/NF-κB信號通路,進而影響下游通路細胞因子的表達,促進腎組織纖維化,加重腎臟損傷,共同參與了IMN的發病。

綜上所述,IMN患者腎組織中炎癥因子TLR4、NF-κB表達水平明顯升高,且兩者間相互作用導致腎組織纖維化,引起腎臟損傷,說明TLR4/NF-κB信號通路介導的炎癥反應在IMN的發生與發展中發揮重要作用,為進一步探索IMN發病機制提供依據,也為IMN的診斷及治療提供新的視角。但本實驗樣本量較少,需加大樣本量得到更有利的實驗結果,同時完善外周血清中炎癥因子的表達進一步探討信號通路在IMN中的表達。