外周血miR-92b-5p與miR-148b-3p在2型糖尿病進展至糖尿病腎病中的表達及交互作用

邢玉微,孫澤楠,柴雪姣,位 庚

(河北省石家莊市第二醫院內分泌科,河北 石家莊 050000)

2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)是一種慢性、非傳染性、多系統疾病,已達到流行程度。T2DM患者的長期高血糖會影響微血管系統,最終導致糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)、視網膜病變和神經病變等微血管并發癥［1］。其中DN是導致終末期腎病的重要原因,是世界范圍內公認的公共衛生問題,特別是我國T2DM患者中DN患病率較高,為21.8%,已成為T2DM患者治療成本和病死率增加的主要因素［2-3］。由于DN起病隱匿、發展緩慢,臨床近年來積極探索DN早期生物學標志物以診斷DN。國外研究顯示,微小RNA(microRNA,miR)在DN中的表達異常,可作為DN嚴重程度的預測因子［4］。國內研究［5-6］顯示,血清miR-92b-5p水平降低、miR-148b-3p水平升高均為DN發生的危險因素,兩種因子均可作為DN診斷的潛在生物標志物。但miR-92b-5p、miR-148b-3p在T2DM進展至DN過程中的水平變化和交互作用尚未明確。基于此,本研究重點探討T2DM進展至DN過程中血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平變化和交互作用,旨在為臨床防治DN提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月—2022年3月我院T2DM患者400例為研究對象,其中非DN200例作為T2DM組,DN患者200例作為DN組。納入標準:①所有患者均符合T2DM診斷標準［7］;②DN組符合DN診斷標準［8］:以尿白蛋白/肌酐(urinary albumin creatinine ratio,UACR)≥30 mg/g或尿蛋白排泄率≥30 mg/24 h為標準,且在3～6個月內重復檢查UACR或尿蛋白排泄率3次,達到或超過臨界值≥2次;④患者知曉本研究,已簽署同意書。排除標準:①腎結石或泌尿系統感染;②惡性腫瘤;③全身性疾病如系統性紅斑狼瘡和血管炎;④在診斷T2DM前確診的慢性腎臟疾病;⑤狼瘡性腎炎或過敏性紫癜性腎炎;⑥嚴重肝病或甲狀腺疾病;⑦懷孕或哺乳期女性;⑧合并大血管病變如冠心病、腦血管病和下肢血管病變。

本研究通過醫院倫理委員會批準。

1.2方法 診斷為T2DM腎功能正常時或DN時收集資料。采集患者晨起空腹靜脈血10 mL,取5 mL血液標本采用au5800全自動生化分析儀(美國貝克曼)檢測血糖、糖化血紅蛋白、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,SCr)、尿酸(uric acid,UA)水平,并檢測DN組尿微量白蛋白/肌酐(albumin creatinine ratio,ACR)水平。血清miR與化驗血生化時同時檢測,取5 mL血液標本離心處理5 min(半徑8 cm,轉速3 500 r/min)取血清,采用實時熒光免疫PCR檢測血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平:采用RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技)提取總RNA,隨后采用逆轉錄試劑盒(美國Promega公司)逆轉錄為cDNA,采用7300實時PCR檢測系統(美國應用生物)和PCR試劑盒(北京華夏遠洋科技)進行擴增。miR-92b-5p上游引物5′-AGGGACGGGACGCGG-TGCAGTG-3′,下游引物5′-GCGAFCACAGAAT-TAATACGAC-3′,循環條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40個循環。miR-148b-3p上游引物5′-GGGTCAGTGCATCACAGAA-3′,下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAG-3′,循環條件:95 ℃ 10 s,60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s,40個循環。以U6為內參基因,其上游引物5′-CTCGCTTCGGCAG-CACATATACT-3′,下游引物5′-ACGCTTCACG-AATTTGCGTGTC-3′。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。應用公式2-△△ct計算血清miR-92b-5p、miR-148b-3p相對表達水平(△ct=ct目標-ct內參,△△ct=△ct實驗-△ct對照)。

1.3觀察指標 ①DN組和T2DM組臨床資料(性別、年齡、體重指數、T2DM病程、吸煙史、飲酒史、收縮壓、舒張壓、血糖、糖化血紅蛋白、HDL-C、LDL-C、TC、TG、BUN、UA)、血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平。②DN組不同分期患者血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平,UACR水平30～299.99 μg/mg、估算腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)≥90 mL·min-1·1.73 m-2判斷為早期,UACR水平≥300 μg/mg、eGFR <90 mL·min-1·1.73 m-2為臨床期。

1.4統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2或fisher精確概率法檢驗。計量資料比較采用t檢驗。采用Spearman分析分析DN組血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平與臨床分期的相關性。通過交互作用分析T2DM進展至DN過程中血清miR-92b-5p與miR-148b-3p的作用,交互作用系數γ<1時呈負向交互作用,當γ=1時無交互作用,當γ>1時呈正向交互作用;當交互作用OR大于兩單獨因素OR值的乘積時為超相乘模型,小于兩單獨因素OR值的乘積時為次相乘模型,等于兩單獨因素OR值的乘積-1時為相加模型。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評價血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平預測DN的價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1臨床資料及血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平 DN組與T2DM組性別、年齡、體重指數、T2DM病程、吸煙史、飲酒史、收縮壓、舒張壓、血糖、糖化血紅蛋白、HDL-C、LDL-C、TC、TG、BUN、UA水平比較,差異無統計學意義(P>0.05);DN組血清SCr、miR-148b-3p水平較T2DM組高,eGFR及血清miR-92b-5p水平較T2DM組低(P<0.05)。見表1。

表1 臨床資料及血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平Table 1 Clinical data and serum miR-92b-5p and miR-148b-3p levels

表1 臨床資料及血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平Table 1 Clinical data and serum miR-92b-5p and miR-148b-3p levels

組別性別(例數,%)男性女性年齡(歲)體重指數T2DM病程(年)吸煙史(例數,%)飲酒史(例數,%)收縮壓(mmHg)DN組122(61.00)78(39.00)61.28±9.3124.26±2.269.18±2.8548(24.00)35(17.50)140.23±19.67T2DM組115(57.50)85(42.50)59.84±8.8423.95±2.118.67±2.7939(19.50)26(13.00)137.94±17.22 χ2/t值0.5071.5861.4181.8081.1901.5671.239 P值0.4760.1140.1570.0710.2750.2110.216 組別舒張壓(mmHg)血糖(mmol/L)糖化血紅蛋白(%)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)DN組79.11±14.509.29±3.077.71±2.561.09±0.342.54±0.824.12±1.352.30±0.76T2DM組77.62±12.838.80±2.917.30±1.981.16±0.382.63±0.863.93±1.282.19±0.69 χ2/t值1.0881.6101.7921.9421.0711.4441.516 P值0.2770.1080.0740.0530.2850.1500.130 組別BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)eGFR(mL·min-1·1.73 m-2)UA(μmol/L)miR-92b-5pmiR-148b-3pDN組5.62±2.3183.64±23.17115.57±22.69317.60±89.572.31±0.480.67±0.12T2DM組5.29±1.7455.60±15.33136.24±28.79304.12±68.953.27±0.610.51±0.10 χ2/t值1.61414.2737.9751.68717.49114.486 P值0.107<0.001<0.0010.093<0.001<0.001

表2 DN組不同分期患者血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平Table 2 Serum miR-92b-5p and miR-148b-3p levels in patients with different stages in the DN group

表2 DN組不同分期患者血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平Table 2 Serum miR-92b-5p and miR-148b-3p levels in patients with different stages in the DN group

臨床分期例數miR-92b-5pmiR-148b-3p早期 1422.51±0.530.63±0.10臨床期581.82±0.400.77±0.15t值8.9267.704P值<0.001<0.001

1 mmHg=0.133 kPa

2.2DN組不同分期患者血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平 DN組臨床分期早期142例,臨床期58例。臨床期患者血清miR-148b-3p水平較早期患者高,血清miR-92b-5p水平較早期患者低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3DN組血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平與臨床分期的相關性 DN組血清miR-92b-5p水平與臨床分期呈負相關關系(r=-0.624,P=0.037),血清miR-148b-3p水平與臨床分期呈正相關關系(r=0.571,P=0.021)。

2.4T2DM進展至DN過程中血清miR-92b-5p與miR-148b-3p的交互作用 以所有患者血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平平均值為界,分為低表達(<平均值)和高表達(≥平均值),通過交互作用分析顯示,miR-92b-5p低表達與miR-148b-3p高表達在T2DM進展至DN過程中呈正向交互作用,差異有統計學意義(P<0.05),且均為次相乘模型。見表3。

表3 T2DM進展至DN過程中血清miR-92b-5p與miR-148b-3p的交互作用Table 3 Interaction of serum miR-92b-5p with miR-148b-3p during the progression of T2DM to DN

2.5血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平預測DN的價值 以DN組為陽性樣本,T2DM組為陰性樣本,繪制miR-92b-5p、miR-148b-3p預測T2DM進展至DN的ROC曲線,結果顯示miR-92b-5p、miR-148b-3p預測的曲線下面積(area under the curve,AUC)分別為0.840、0.812,二者聯合預測的AUC最大,為0.911。見表4、圖1。

圖1 血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平預測DN的ROC曲線

表4 血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平預測DN的價值Table 4 Value of serum miR-92b-5p and miR-148b-3p levels in predicting DN

3 討 論

T2DM進展至DN是由多種因素綜合作用所致,包括血糖控制不佳、脂肪代謝異常、腎臟結構和功能異常等［9-10］。由于DN早期是可逆的,因此在T2DM早期積極預防DN比DN的治療更為重要［11］。DN發病機制復雜,常規檢測手段存在一定的局限性,如微量白蛋白尿是DN常規篩查的早期標志物,但即使沒有微量白蛋白尿,也可能發生腎臟損害［12］。因此臨床亟需早期識別和防治DN的標志物。

近年來miR在DN發生發展中的作用越來越受臨床關注,且miR穩定于血清中,血清miR檢測能輔助臨床醫生了解DN的發生機制,并為DN的早期預測和診斷提供了新方法［13-14］。相關研究［15-16］顯示,miR-92b在腎臟多種病理生理過程中發揮作用,如能減少阿霉素誘導的腎病中的腎水腫。動物學研究［17］顯示,miR-92b-5p具有靶向下調高遷移率族蛋白B1水平的作用,從而抑制DN大鼠炎癥反應,減輕腎損傷。本研究顯示DN患者血清miR-92b-5p水平明顯低于T2DM患者,說明miR-92b-5p可能與DN的發生有關。其原因可能在于血清miR-92b-5p水平降低可導致高遷移率族蛋白B1表達上調,高遷移率族蛋白B1是由活化腎臟細胞釋放的炎性因子,具有促炎作用,其表達水平升高可引起并加重腎小管間質炎癥,從而導致腎損傷,最終促進T2DM進展至DN［5］。進一步通過相關性分析顯示DN患者血清miR-92b-5p水平與臨床分期呈負相關,說明血清miR-92b-5p水平降低導致腎損傷加重,最終導致DN病情加重。

此外,Ghoreishi等［18］顯示T2DM患者血清miR-148b-3p處于明顯高表達狀態,檢測其血清水平在T2DM中具有潛在的診斷用途。在上述研究基礎上,本研究進一步深入分析顯示,DN患者血清miR-148b-3p水平明顯高于T2DM患者,提示miR-148b-3p可能參與DN的發生。有證據［19］表明miR-148b-3p表達水平升高能加重炎癥反應,促進腎損傷進展,因此血清miR-148b-3p水平升高能促進T2DM向DN進展。崔兆山等［20］研究也顯示DN患者血清miR-148b-3p水平明顯高于糖尿病和體檢健康者,并指出miR-148b-3p參與DN的發生發展。支持本研究結果結論。本研究還顯示,DN患者血清miR-148b-3p水平與臨床分期呈正相關,進一步說明血清miR-148b-3p水平升高可導致腎損傷加重,促進DN的病情進展。但miR-148b-3p在DN發生發展中的具體作用機制尚未明確,未來工作中仍需進一步深入探討。

本研究通過交互作用分析顯示,在T2DM進展至DN過程中血清miR-92b-5p低表達與miR-148b-3p高表達呈次相乘模型的正向交互作用。說明血清miR-92b-5p低表達與miR-148b-3p高表達可相互影響,共同促進T2DM向DN進展。原因考慮為血清miR-92b-5p水平降低、miR-148b-3p水平升高均能加重腎損傷,從而促進DN發生。此外,血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平預測T2DM進展至DN的AUC分別為0.840、0.812,二者聯合預測的AUC最大,為0.911,說明血清miR-92b-5p、miR-148b-3p水平檢測在DN早期預測方面具有良好效能,早期檢測可指導臨床評估T2DM進展至DN的風險,從而指導臨床制定相關干預措施。

綜上可知,在T2DN進展至DN過程中血清miR-92b-5p水平降低、miR-148b-3p水平升高,miR-92b-5p低表達、miR-148b-3p高表達共同促進T2DM向DN進展,早期檢測有助于預測DN發生風險。