泡騰沉淀法制備呋塞米納米晶的工藝及藥劑學特性*

馮鎖民,趙子齊,張佳欣,李惠民,郭惠輝,薛 穎,朱文璟,姚天驕,時培月

(1.西安醫(yī)學院 藥學院,陜西 西安 710021;2.商洛職業(yè)技術學院,陜西 商州 726000;3.陜西醫(yī)藥控股集團 山海丹藥業(yè)股份有限公司,陜西 西安 710075)

呋塞米(furosemide),又名呋喃苯胺酸,俗稱速尿,化學名稱為2-[(2-呋喃甲基)氨基]-5-(氨磺?；?-4-氯苯甲酸,分子式C12H11ClN2O5S,相對分子質(zhì)量約為330.75,熔點為208～213 ℃。呋塞米為白色或白色結晶性粉末,無臭味,溶于丙酮、甲醇、二甲基甲酰胺,略溶于乙醇,不溶于水[1]。呋塞米為強效利尿藥,臨床上用于心衰、水腫、高血壓及高鈣血癥等的治療[2]。呋塞米屬于生物藥劑學分類系統(tǒng)(BCS)的Ⅳ類藥物[3],低滲透性和低溶解性限制了其溶出速率和生物利用度的發(fā)揮。研究報道的增加呋塞米水中溶解度的方法有與堿成鹽[1,4-5],用β-環(huán)糊精進行包合[6-7],制成固體分散體等[8-10]。另一種策略是通過降低呋塞米原料的粒徑,增加微粒的比表面積以改善其溶出性能。其中納米晶體技術(納米混懸液)因載藥量高,生物相容性好,便于工業(yè)化生產(chǎn),受到普遍關注。中國有關呋塞米納米晶研究未見相關文獻報道,國外僅有學者報道采用介質(zhì)研磨技術[11]、抗溶劑沉淀技術[12]和噴霧閃蒸(SFE)技術[13]制備呋塞米納米晶。作者建立了一種新穎的泡騰沉淀技術用于呋塞米納米晶的制備,通過單因素及正交設計優(yōu)化實驗條件,用HPLC法測定呋塞米納米晶的載藥量及體外溶出度。該研究為進一步設計和開發(fā)呋塞米新制劑,改善其溶出度,提高生物利用度,提供實驗和理論參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

呋塞米原料藥:質(zhì)量分數(shù)99.59%,批號2018 0312,武漢遠成科技公司;呋塞米對照品:質(zhì)量分數(shù)99.3%,批號100544-201503,中國食品藥品檢定研究院;呋塞米納米晶:批號20190426,20190427,20190428,自制;碳酸鈉:分析純,鄭州派尼化學試劑廠;水:娃哈哈純凈水,市售;甲醇:色譜純,廣東光華科技股份有限公司;聚乙烯吡咯烷酮-30(PVPK30)、羥丙甲基纖維素(HPMC):上海化學試劑公司;泊洛沙姆188:藥用級,沈陽藥科大學制藥廠;十二烷基硫酸鈉(SDS)、氫氧化鈉:分析純,天津市天力化學試劑有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、冰乙酸:分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司。

激光粒度儀:Malvern Zetamaster ZEN-3600,英國馬爾文儀器有限公司;高效液相色譜儀(HPLC):Agilent 1260,色譜柱:Agilent HC-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),美國安捷倫科技公司;智能藥物溶出試驗儀:D-800LS,天津市天大天發(fā)科技有限公司;磁力攪拌器:DF-101S,河南佰澤儀器有限公司;電子天平:FA1004B,上海越平科學儀器有限公司;高頻數(shù)控超聲波清洗器:KQ-300TDB,昆山市超聲儀器有限公司;超低溫冰箱:-86 ℃,青島海爾;冷凍干燥機:FD-1,鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素考察呋塞米納米晶的制備

參照藥物納米晶制備的溶劑-反溶劑沉淀法[12-14],結合呋塞米呈弱酸性的性質(zhì),采用堿性溶液作為溶劑溶解,酸性溶液作為反溶劑沉淀進行制備,并對各種條件下制備的呋塞米納米晶用馬爾文激光粒度儀測定平均粒徑和多分散指數(shù)(PDI)作為評價指標進行評價。

取相同量的呋塞米(約40 mg)加入到堿性溶液中使其溶解,在水浴25 ℃、250 W超聲條件下,將該溶液用注射器按一定速度注入到含有穩(wěn)定劑(約40 mg)的0.1 mol/L稀鹽酸溶液中,維持15 min,即得呋塞米納米晶。

1.2.1.1 堿性溶劑的篩選

以PVPK30為穩(wěn)定劑,0.1 mol/L稀鹽酸溶液為反溶劑,分別用氫氧化鈉溶液、碳酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液溶解呋塞米原料,用注入法制備呋塞米納米晶,測定所制納米晶的平均粒徑和PDI。

1.2.1.2 穩(wěn)定劑種類的篩選

取呋塞米的碳酸鈉溶液,用注入法分別加入到含有不同種類穩(wěn)定劑(約40 mg)PVPK30、SDS、泊洛沙姆188、HPMC、m(PVPK30)∶m(泊洛沙姆188)=1∶1的稀鹽酸溶液,超聲攪拌制備呋塞米納米晶,測定所制納米晶的平均粒徑和PDI。

1.2.1.3 制備溫度的篩選

以碳酸鈉溶液為溶劑,稀鹽酸溶液為反溶劑,PVPK30為穩(wěn)定劑,用注入法分別在3、25、40 ℃制備呋塞米納米晶,并測定所制備納米晶的平均粒徑和PDI。

1.2.1.4 制備儀器的篩選

為了考察所選儀器對制備呋塞米納米晶的影響,將呋塞米溶解在碳酸鈉溶液中,注入到含有穩(wěn)定劑PVPK30的稀鹽酸溶液中,分別采用磁力攪拌器和高頻數(shù)控超聲波清洗器制備呋塞米納米晶,分別測定所制納米晶的平均粒徑和PDI。

1.2.2 正交實驗優(yōu)化呋塞米納米晶的制備工藝參數(shù)

根據(jù)單因素篩選結果,分別以m(藥物)∶m(穩(wěn)定劑)(A)、呋塞米藥物溶液的注入時間(B)、V(溶劑)∶V(反溶劑)(C)、超聲時間(D)為因素,設計四因素三水平正交實驗,見表1,并按正交實驗制備呋塞米納米晶。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.3 HPLC法測定呋塞米納米晶的溶出度

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent HC-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動相為甲醇-φ(冰醋酸)=3%水溶液(體積比為45∶55),檢測波長為271 nm,流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃,進樣量為20 μL。

1.2.3.2 溶液的配制

(1)呋塞米對照品溶液的配制。精密稱取呋塞米對照品適量于容量瓶中,加流動相溶解,制成質(zhì)量濃度1.02 mg/mL呋塞米對照品的儲備液。

(2)呋塞米原料藥溶液的配制。精密稱取呋塞米原料藥20 mg,置100 mL容量瓶中,加流動相振搖溶解,過濾,精密吸取續(xù)濾液5 mL于100 mL容量瓶中,加流動相稀釋成質(zhì)量濃度10 μg/mL的溶液。

(3)呋塞米納米晶溶液的配制。精密稱取呋塞米納米晶冷凍干燥粉末25 mg于50 mL容量瓶中,加流動相振搖溶解,過濾,精密吸取續(xù)濾液0.4 mL于10 mL容量瓶中,加流動相稀釋成質(zhì)量濃度20 μg/mL的溶液。

1.2.3.3 方法學考察

(1) 線性關系。精密吸取呋塞米對照品儲備液1 mL于25 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度搖勻,再分別精密吸取1、2、3、4、5、6 mL于10 mL容量瓶,加流動相稀釋至刻度,充分搖勻。按照1.2.3.1色譜條件分別進樣20 μL進行測定,記錄呋塞米的峰面積(A),與進樣的ρ(呋塞米)進行線性回歸,得線性方程。

新型集成管塊的特點：①將分散凌亂的各個管線和所有零部件全部集中在管塊內(nèi)；②集成化水平高，提升了防盜和防損功能；③標準化程度高，模塊化產(chǎn)品，可實現(xiàn)快速安裝，方便后期維修更換；④與周邊環(huán)境景觀的協(xié)調(diào)性更好，更美觀。

(2)精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率實驗按相關方法進行操作。

1.2.4 呋塞米納米晶載藥量測定

取1.2.2制備的3批呋塞米納米晶,分別進行冷凍干燥,取冷凍干燥的呋塞米納米晶適量,照1.2.3.2(3)配制溶液,按1.2.3.1色譜條件平行進樣3次,記錄峰面積,代入線性方程,計算載藥量。

1.2.5 呋塞米溶出度測定

呋塞米的溶出度測定采用槳法,參照文獻[15]及2020版中國藥典[1,16]的操作方法。以磷酸鹽緩沖液(pH=5.8)900 mL為溶出介質(zhì),介質(zhì)溫度控制在37 ℃,轉(zhuǎn)速為50 r/min。分別取相當于20 mg呋塞米質(zhì)量的原料藥、冷凍干燥的納米晶、原料藥與確定比例穩(wěn)定劑的混合物,各平行5份于溶出杯中,啟動溶出儀。t=0、5、10、15、30、45、60 min,分別取溶液5 mL,用0.22 μm的微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液2 mL作為供試品溶液,同時每次取樣后補加5 mL空白溶出介質(zhì)。按1.2.3.1 色譜條件測定,計算累積溶出度,繪制溶出曲線。

2 結果與討論

2.1 呋塞米納米晶制備單因素篩選結果

2.1.1 堿性溶劑篩選結果

不同堿溶劑制備的呋塞米納米晶的平均粒徑和PDI見表2。

表2 不同堿溶液制備的呋塞米納米晶的平均粒徑和PDI1)

由表2可知,采用碳酸鈉溶液作為堿性溶劑,制備的呋塞米納米晶PDI較小,混懸體系最穩(wěn)定,平均粒徑與碳酸氫鈉溶液接近,因此,選用碳酸鈉溶液作為堿性溶劑制備呋塞米納米晶。分析原因可能是反應過程中產(chǎn)生的CO2氣體阻止了新生成納米晶的聚集,促進納米晶的分散,從而比無氣體產(chǎn)生的氫氧化鈉溶液具有較小的平均粒徑和PDI,同時制備過程中生成的氯化鈉是人體本身具有的內(nèi)源性物質(zhì),不需要除雜。為了區(qū)別于酸堿沉淀法,相關文獻也未見報道,稱該方法為泡騰沉淀法。

不同穩(wěn)定劑制備的呋塞米納米晶的平均粒徑和PDI見表3。

表3 不同穩(wěn)定劑制備的呋塞米納米晶的平均粒徑和PDI1)

由表3可知,PVPK30作為穩(wěn)定劑制備的呋塞米納米晶平均粒徑和PDI最小,因此,選擇PVPK30為制備呋塞米納米晶的穩(wěn)定劑。

2.1.3 制備溫度篩選結果

不同溫度下制備的呋塞米納米晶的平均粒徑和PDI見表4。

表4 不同溫度下制備的呋塞米納米晶的平均粒徑和PDI1)

由表4可知,溫度對呋塞米納米晶制備的影響不顯著,但室溫25 ℃制備的呋塞米納米晶平均粒徑和PDI最小。

2.1.4 制備儀器篩選結果

不同儀器制備的呋塞米納米晶的平均粒徑和PDI見表5。

表5 不同儀器制備的呋塞米納米晶的平均粒徑和PDI(n=3)

由表5可知,超聲波清洗器制備的呋塞米納米晶比磁力攪拌器具有更小的平均粒徑和PDI,分析原因是超聲波借助分子間的振動,阻止了納米晶的聚集,使得形成的納米晶粒徑更小,穩(wěn)定性更高,而磁力攪拌形成漩渦,進行圓周運動,不利于納米晶的分散。

2.2 正交實驗結果

按正交實驗設計制備呋塞米納米晶,測得的平均粒徑和PDI見表6。按表7的評價標準進行打分,以平均粒徑得分(Y1)和PDI得分(Y2)為評價指標,分別賦予權重系數(shù)0.6和0.4,計算綜合評分值Y=Y1×60%+Y2×40%,并用正交助手軟件進行數(shù)據(jù)處理。方差分析結果見表8。

表6 L9(34)正交實驗結果

表7 平均粒徑和PDI評價標準

表8 加權方差分析表

由表6和表8可知,影響因素順序為C>D>A>B,這些因素對呋塞米納米晶的平均粒徑和PDI的影響沒有顯著性差異,優(yōu)化的處方為A1B1C2D2,即m(呋塞米原料藥)∶m(PVPK30)=1∶1,注入時間10 s,V(溶劑)∶V(反溶劑)=1∶20,超聲時間15 min。優(yōu)化的制備工藝為取呋塞米40 mg溶于3 mLc(碳酸鈉)=0.5 mol/L溶液中,將該溶液用注射器在10 s內(nèi)注入到溶有40 mg PVPK30的60 mLc(鹽酸)=0.1 mol/L溶液中,從注入開始計時,在25 ℃水浴中,于250 W的超聲功率攪拌15 min。

2.3 正交實驗結果的驗證

按2.2正交實驗結果,試制的3批呋塞米納米晶樣品平均粒徑和PDI比較接近,結果見表9,表明正交實驗優(yōu)化的參數(shù)和制備工藝比較合理,質(zhì)量穩(wěn)定,重復性好。

表9 正交實驗結果驗證

2.4 HPLC測定呋塞米含量的方法學考察結果

線性方程為A=59.886ρ-40.821(R2=0.998 8),即ρ(呋塞米)=4.08～24.48 μg/mL與吸收峰面積線性關系良好。呋塞米的HPLC圖見圖1。

t/min

精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率實驗中呋塞米的RSD值分別為0.72%、1.18%、0.96%、1.04%,平均加樣回收率為98.45%,表明該方法穩(wěn)定、可行。

2.5 呋塞米納米晶載藥量測定結果

3批呋塞米納米晶的載藥量測定結果見表10。

表10 呋塞米納米晶的載藥量測定結果(n=3)

由表10可知,平均載藥量約為56.33%,表明正交實驗優(yōu)化的呋塞米納米晶的制備參數(shù)重復性好,制備工藝穩(wěn)定。

2.6 呋塞米納米晶溶出度測定結果

不同類型呋塞米的溶出曲線見圖2。

t/min

由圖2可知,相同時間內(nèi),累積溶出度關系為呋塞米納米晶>呋塞米原料藥與穩(wěn)定劑PVPK30的物理混合物>呋塞米原料藥。t=30 min,呋塞米納米晶的累積溶出度約為呋塞米原料藥的2倍多,同時100%溶出,達到了中國藥典和美國藥典的要求[15],而原料藥只溶出了45%,達不到藥典要求,說明呋塞米制成納米晶后其溶出速率和溶出度明顯提高。雖然穩(wěn)定劑PVPK30能加快呋塞米的溶出速率,但不能改變其最大溶出度。

3 結 論

研究以碳酸鈉為泡騰源,稀鹽酸為反溶劑,聚乙烯吡咯烷酮-30(PVPK30)為穩(wěn)定劑,t=25 ℃,超聲15 min的條件下,采用泡騰沉淀法優(yōu)化的條件制備的呋塞米納米晶平均粒徑為218.7 nm,PDI為0.248,平均載藥量為56.33%,體外溶出度高于呋塞米原料藥2倍。表明泡騰沉淀法相比其他方法制備的呋塞米納米晶具有較小的平均粒徑和PDI,其累積溶出度顯著提高。