草銨膦脅迫下小麥葉片轉錄組分析

于金萍,張 惟,李 琦,白鵬華,崔新儀,劉亦學

(1.天津農學院,天津 300384;2.天津市農業科學院 植物保護研究所,天津 300381)

小麥是世界主要糧食作物之一,其種植面積僅次于水稻[1]。小麥的穩產、高產、輕簡化栽培及小麥品質與國家糧食安全和社會穩定有著密切的聯系[2-5]。近年來,隨著新型耕作和施肥制度等的持續推廣,小麥田禾本科雜草發生蔓延速度加快,嚴重影響小麥產量,增加小麥種植成本[6-9]。因此,田間簡化雜草防治技術的研究成為科研人員關注的重點問題。

目前,麥田中闊葉雜草及部分禾本科雜草防治較為簡單,使用異丙隆[10-11]、吡氟酰草胺[12]、氟噻草胺[13]和炔草酯[14]等常用麥田除草劑即可防治。但是,田間野燕麥、雀麥、節節麥和大穗看麥娘等雜草,由于和小麥親緣關系較近,基因同源性高且代謝途徑相近,使用常規麥田除草劑無法有效防除上述雜草,導致近年來近緣雜草蔓延迅速,逐漸成為麥田主要惡性雜草,嚴重影響小麥的生長,造成小麥減產甚至絕產[15-18]。上述小麥近緣雜草防治困難,增加了小麥田間雜草的防治成本。因此,亟待挖掘、創制能夠抵御滅生性除草劑的小麥資源,輕簡化小麥田間雜草有效防治技術,且不影響小麥產量,降低小麥種植的人工投入和種植成本,增加小麥產品在國際市場的競爭力。前人研究表明,咪唑乙煙酸能夠有效防治一年生禾本科雜草馬唐、稗草以及闊葉雜草蒼耳等[19];煙嘧磺隆常用于防除玉米田中一年生雜草[20]。大部分谷子栽培種及野生近緣種均不能抵御咪唑乙煙酸和煙嘧磺隆,但經育種創制的冀谷32和冀谷33卻能夠有效抵御咪唑乙煙酸及煙嘧磺隆[19,21],于是在谷子種植生產中形成了“(抗除草劑)冀谷+除草劑”的雜草防治模式?；诳共蒌@膦bar基因和pat基因的研究與應用,目前,已經發現、創制了抗草銨膦大豆、玉米、油菜、甜菜、棉花等材料[22-24],而發展“滅生性除草劑+抗除草劑作物”是現代農業可持續發展的新模式。

草銨膦(Glufosinate-ammonium)是通過抑制谷氨酰胺合成的有機磷類除草劑,能夠滅生性的殺死小麥、節節麥、燕麥、雀麥[25]等絕大部分綠色植物。因此,創制抗草銨膦小麥新種質是有效控制小麥野生近緣雜草,實現“抗除草劑資源+草銨膦”的新型輕簡化栽培技術的有效手段。創制材料的根本在于研究草銨膦在小麥中的代謝信號通路,挖掘關鍵基因,并利用、改造基因。目前,轉錄組測序技術(RNA-seq)是高效挖掘相關基因的常規手段,已經在小麥耐鹽基因挖掘、抗旱基因挖掘中發揮重要作用[26-28]。

本研究通過對草銨膦處理苗期小麥的表型鑒定,篩選用于RNA-seq樣本處理的濃度及時間。利用RNA-seq對基因表達量進行分析,挖掘關鍵差異表達基因,并通過隱馬爾可夫(HMM)算法等相關生物信息學技術挖掘關鍵基因家族成員,明確該基因家族在小麥染色體中分布情況及表達模式,從而為后續解析關鍵基因功能,利用基因編輯手段改造并利用基因提供有效信息,為創制抗除草劑種質資源提供理論基礎及技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及小麥植株處理

供試小麥品種為春小麥津強11號和冬小麥津農6號,由天津市農業科學院農作物研究所提供。小麥種子經 75%乙醇表面消毒3～4 min,并用蒸餾水沖洗4～5次,置于有2層濕潤濾紙的培養皿中,在24 ℃黑暗條件下培養至萌發,然后播種至盛有營養土的塑料盆中(直徑10 cm),播種深度3～5 cm,每盆播種10粒,播種后轉至人工氣候箱光照培養(16 h光照/8 h黑暗)。

200 g/L草銨膦水劑由浙江新安化工集團股份有限公司提供。為了篩選用于RNA-seq樣本處理的濃度及時間,利用草銨膦于小麥植株三葉一心時進行莖葉噴霧處理。草銨膦使用濃度選取市場推薦用量(1 740 g/hm2)的1倍濃度(1×,1 740 g/hm2)、2倍濃度(2×,3 480 g/hm2)、3倍濃度(3×,5 220 g/hm2)和4倍濃度(4×,6 960 g/hm2),兌水量為450 L/hm2,在處理的0,3,9,12 h進行小麥的表型觀察。

1.2 轉錄組測序

應用TIANGEN公司RNA提取試劑盒(DP762-T1A)提取總RNA,由上海派森諾生物科技有限公司采用Illumina NovaSeq測序平臺進行轉錄組測序。轉錄組原始數據處理與質控樣品經過上機測序,得到圖像文件,由測序平臺自帶軟件進行轉化,生成FASTQ的原始數據(Raw Data),即下機數據。對每個樣品的Raw Data分別進行統計,包括樣品名、Q20、模糊堿基所占百分比。測序數據包含一些帶接頭、低質量的reads,這些序列會對后續的信息分析造成很大的干擾,因此需要對測序數據進行進一步過濾。數據過濾的標準主要包括:①采用Cutadapt去除3′端的接頭,去除的部分與已知接頭有至少10 bp Overlap;②去除平均質量分數低于Q20的reads。

1.3 比對分析

使用TopHat2的升級版HISAT2(https://daehwankimlab.github.io/hisat2/)軟件將過濾后的reads比對到參考基因組(https://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)上,采用基因覆蓋均一度、飽和度分析對測序質量以及測序數據量進行評估。

1.4 表達量分析

使用HTSeq(0.9.1)統計比對到每一個基因上Read Count值,作為基因的原始表達量。reads計數與基因的真實表達水平,以及基因的長度和測序深度呈正相關。為了使不同基因、不同樣本間的基因表達水平具有可比性,采用FPKM(Fragments Per Kilo bases per Million fragments)對表達量進行標準化,FPKM是每百萬片段中來自某一基因每千堿基長度的片段數目,對于Pair-End測序,每個Fragments會有2個reads,FPKM只計算2個reads能比對到同一個轉錄本的Fragments數量。

1.5 差異表達基因分析

轉錄組主要目的是尋找不同比較組之間的差異基因,以揭示導致比較組之間不同的分子機制。采用 DESeq(1.39.0)軟件包對基因表達進行差異分析[29],篩選差異表達基因條件為:表達差異倍數|log2FoldChange|>1,顯著性P-value<0.05。

1.6 生物信息學分析

用DNAman 8.0進行核苷酸序列比對[30];通過HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools)預測氨基酸結構域,采用HMM算法通過HMMER軟件進行全家族成員調取,并使用mapchart進行染色體定位可視化[31],使用TBtools進行序列統計分析及可視化[32]。

2 結果與分析

2.1 草銨膦處理苗期小麥表型鑒定

由圖1可知,隨著草銨膦溶液濃度升高,小麥葉片受到脅迫逐漸增強。葉片出現萎蔫、失綠等壞死癥狀的時間隨濃度升高而縮短。隨著處理時間的延長,小麥幼苗逐漸死亡。在1×、2×和3×草銨膦溶液處理下,藥后3,9 h小麥表型變化差異不大。4×草銨膦溶液處理后3,9 h的表型差異明顯,12 h下葉片均枯萎。由于干枯死亡的葉片RNA含量少,且完整性差,不適宜進行RNA提取及轉錄組測序,因此,選擇4×草銨膦溶液處理小麥0,3,9 h后的葉片進行轉錄組測序,挖掘與草銨膦脅迫密切相關的基因。

2.2 草銨膦脅迫基因挖掘

由于冬小麥種植面積遠高于春小麥,因此,選用冬小麥津農6號進行基因挖掘研究。以草銨膦處理前(0 h)的小麥幼苗為對照,對處理3,9 h的轉錄組數據進行差異基因分析。結合小麥基因組注釋信息,發現TraesCS4A02G044000基因在草銨膦處理津農6號后受到誘導,上調表達顯著;該基因表達量在草銨膦處理3,9 h后分別提升4.3,16.7倍(圖2),且持續增加,說明該基因在抵御草銨膦脅迫過程中起到重要作用。

進一步序列分析表明,TraesCS4A02G044000基因長度為1 975 bp,位于小麥第4同源群A基因組。TraesCS4A02G044000定位于4A上的36 611 408～36 614 890 bp的反義鏈上(表1)。該基因存在1個內含子和2個外顯子,編碼序列長度1 155 bp,能夠編碼長度為384 aa的蛋白(圖3-A)。蛋白結構域分析表明,該基因編碼的蛋白存在1個信號肽、1個DUF568結構域和1個b561結構域。DUF568結構域位于88～186 aa,功能未知;b561結構域位于204～333 aa,參與細胞色素形成(圖3-B)。

表1 TraesCS4A02G044000家族成員Tab.1 Family members of TraesCS4A02G044000

A.TraesCS4A02G044000基因序列結構圖;B.TraesCS4A02G044000基因編碼蛋白結構域(蛋白結構域由信號肽、DUF568、b561組成)。A. Sequence structure of TraesCS4A02G044000; B. Protein domain of TraesCS4A02G044000 encoded (protein domain consists of signal peptide, DUF568 and b561).

2.3 TraesCS4A02G044000及其家族成員分析

由以上分析可知,TraesCS4A02G044000基因編碼的氨基酸含有1個DUF568結構域和1個b561結構域,需在小麥基因組挖掘該基因所在家族的全部成員中既含有DUF568結構域也含有b561結構域的基因。結果在小麥中發現了34個含有DUF568結構域的基因,55個含有b561結構域的基因,其中,12個基因成員同時含有DUF568結構域和b561結構域。

進一步分析12個成員在染色體的位置,發現該家族成員位于第4,5,7同源群,TraesCS4A02G044400等6個成員來自第4同源群,TraesCS5A02G278800等3個成員來自第5同源群,TraesCS7A02G255600等3個成員來自第7同源群(表1)。

2.4 TraesCS4A02G044000及其家族成員進化分析

聚類分析表明,上述12個成員分別屬于4個基因,TraesCS4D02G265500、TraesCS4B02G265500、TraesCS4A02G044400為1個基因在A、B、D染色體的同源基因;TraesCS4D02G265000、TraesCS4B02G265100、TraesCS4A02G044000屬于同一個基因;TraesCS7B02G152000、TraesCS7A02G255600、TraesCS7D02G254000屬于同一個基因;TraesCS5B02G278100、TraesCS5D02G285700、TraesCS5A02G278800屬于同一個基因。通過差異表達基因分析篩選出的草銨膦脅迫處理小麥幼苗后上調基因為TraesCS4A02G044000,其位于第4,5,7同源群的聚類在一起,與第4同源群的另外1個基因關系相對較遠(圖4)。

圖4 TraesCS4A02G044000及其家族成員聚類分析Fig.4 Cluster analysis of TraesCS4A02G044000 family members

為了進一步研究3組同源基因群是否受到草銨膦脅迫處理的影響,分析了12個基因在草銨膦脅迫下的表達模式。結果發現,位于第4同源群A、B、D染色體的TraesCS4D02G265000、TraesCS4B02G265100和TraesCS4A02G044000基因在草銨膦脅迫處理下顯著上調表達,說明該3個基因表達量受到草銨膦脅迫誘導顯著,參與了小麥耐草銨膦脅迫(圖5)。

圖5 TraesCS4A02G044000家族成員在草銨膦脅迫處理下的基因表達模式分析Fig.5 Gene expression pattern analysis of TraesCS4A02G044000 family members under glufosinate-ammonium stress

3 結論與討論

小麥是異源六倍體植物,基因組大而且復雜,重復序列多[33]。因此,從小麥自身研究出發,通過草銨膦脅迫處理,比較不同時間處理后的差異表達基因,揭示小麥參與草銨膦脅迫的特定分子機制,為進一步篩選抗草銨膦相關基因提供理論依據。本研究篩選出用于轉錄組測序的草銨膦處理苗期小麥的濃度(4×,6 960 g/hm2)和時間(0,3,9 h),對轉錄組的表達量進行統計,經標準化處理、篩選后發現,TraesCS4A02G044000基因受到草銨膦脅迫的顯著誘導;在此基礎上進一步分析了該基因編碼蛋白的結構域,并用保守結構域調取小麥中的全家族成員,進而分析該家族在抗草銨膦中的潛在作用。

結構域分析發現,從該基因家族中調取的12個成員都存在DUF568結構域和b561結構域。DUF568結構域在植物中功能未知,可在今后重點研究,從而解析該結構域如何在抗草銨膦中發揮作用。前人研究表明,細胞色素b561在植物中成員眾多[34],b561結構域是細胞色素b561(Cyt B561)的典型結構域,細胞色素b561是高等植物的質膜(PM)中存在一種特定的高電位、抗壞血酸還原的b型細胞色素[35-36]。研究表明,細胞色素b561可能構成了一類新的跨膜電子傳遞蛋白,存在于多種真核細胞中[37]。位于細胞膜上的膜蛋白,在跨膜信號傳遞過程中扮演著不可或缺的角色,可感受外界刺激并將此刺激向細胞內部傳遞,從而調控植物響應外界的環境刺激。草銨膦的作用機理之一是促進銨離子大量累積,導致細胞膜內外離子平衡遭到破壞[38]。因此,基于b561可能構成新的跨膜電子傳遞蛋白的潛在功能和草銨膦引起的離子濃度失衡,本研究推測噴施草銨膦的植株某些跨膜傳導系統受到了一定的破壞。因而,電子信號傳遞的重要因子細胞色素b561可能在抵御草銨膦中發揮作用,或者是草銨膦破壞了電子信號傳導,從而引發了細胞色素b561編碼基因表達水平的改變。因此,無論細胞色素b561和草銨膦是何種關系,細胞色素b561都可能是調節植物抵御草銨膦脅迫的重要候選因子,可通過基因編輯,敲除細胞色素b561編碼基因,深入研究該因子的功能。

通過基因表達模式分析發現,位于第4同源群A,B,D染色體的TraesCS4D02G265000、TraesCS4B02G265100和TraesCS4A02G044000基因在草銨膦脅迫下顯著上調,說明該3個基因表達量受到草銨膦脅迫誘導,參與小麥耐草銨膦脅迫。上述12個基因家族成員,是否存在功能冗余,或成員之間是否協同發揮作用還未可知。目前,隨著小麥泛基因組及大量重測序數據的公布,在今后明確上述基因具體功能的基礎上,研究基因的自然變異情況,在育種中深度利用優異等位基因,從而利于抗草銨膦育種水平的提升;實現滅生性除草劑在小麥田間控制小麥野生近緣雜草,從而解決小麥田禾本科雜草控制難,生產成本高的現狀。