荷斯坦奶牛FABP4基因結構與功能分析

王川川,母 童,李德生,張 迪,李蕾蕾,張 娟,顧亞玲

(寧夏大學 農學院,寧夏 銀川 750021)

脂肪酸結合蛋白(Fatty acid binding proteins,FABPs)是胞內脂質結合蛋白超家族成員。 FABPs蛋白可結合長鏈脂肪酸和其他具有生物活性的配體以促進其在細胞內的定位[1],也可以影響細胞內的脂質通量、代謝和信號傳導[2]。在奶牛乳腺組織中,FABP3、FABP4和FABP5均高表達,并且在哺乳期間顯著上調[3]。FABPs作為進化上保守的蛋白質,其獨特的家族成員,如FABP1、FABP3、FABP4等具有調節脂肪酸代謝相關基因轉錄的能力[4]。其中FABP4常被作為脂肪細胞分化成熟的標志基因,通過與激素敏感性脂肪酶(Hormone-sensitivetriglayceridelipase,HSL)和過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)的相互作用在維持脂肪細胞穩態、調節脂肪分解和生成方面發揮作用[5]。最早對牛脂肪酸結合蛋白4(Fatty acid binding protein 4,FABP4)的研究表明[6],牛背最長肌中FABPs的活性隨著安格斯牛和日本和牛的大理石花紋分數的增加而增加。目前,已經鑒定出FABP4是影響山東黑牛和魯西黃牛脂肪沉積的重要候選標記基因,這為改善肉質和產生新品種牛提供了新的思路[7]。FABP4在牛中被定位在14號染色體(46 833 665～46 838 053),該位置富含產奶性狀的數量性狀基因座(Quantitative trait loci,QTL),這表明它可能是產奶的候選基因或標記。Marchitelli等[8]發現,FABP4還是影響乳脂成分的重要基因,主要影響牛奶中的中鏈和長鏈脂肪酸水平。因此,了解FABP4基因的表達調控規律有助于改善家畜的肉質及牛奶中乳脂的成分。

目前,有關FABP4基因在荷斯坦奶牛乳脂中的相關研究較少。基于前期對荷斯坦奶牛高、低乳脂率組的轉錄組測序數據分析,確定FABP4作為影響奶牛乳脂代謝的關鍵功能候選基因[9],但目前FABP4在奶牛乳脂合成中的作用機制還不確定,故對其進行乳脂合成方面的深入研究是非常有必要的。本研究旨在通過克隆荷斯坦奶牛FABP4基因的CDS區,通過生物信息學分析FABP4基因的分子結構、功能、蛋白特性及啟動子等,并運用qRT-PCR檢測FABP4基因在泌乳中期荷斯坦奶牛各組織中的表達,為進一步研究FABP4基因在荷斯坦奶牛乳脂調控中的作用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所用荷斯坦奶牛均來自寧夏農墾賀蘭山奶業茂盛牧場,奶牛的小腸、肝臟、乳腺、心臟、子宮、腎臟及卵巢組織樣品均為寧夏回族自治區反芻動物分子細胞育種重點實驗室前期采集(3頭泌乳中期、無乳房疾病的荷斯坦奶牛),剪碎組織后裝入1.5 mL凍存管,迅速放入液氮中帶回實驗室-80 ℃保存備用。本試驗所用的原代BMECs來自本實驗室前期通過膠原酶Ⅰ消化法分離獲得,且采集乳腺組織的奶牛也處于泌乳中期。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑盒(TaKaRa,大連);DNA膠回收試劑盒(生工,上海);反轉錄試劑盒購自諾唯贊生物科技股份有限公司;DL2000 DNA Marker購自北京百泰克生物技術有限公司;2×Taq DNA Master Mix購自諾唯贊公司;pMD18-T Vector Cloning Kit(寶生生物,大連);2×SYBR Green PCR Master Mix(艾科瑞,長沙);DH5α感受態細胞購自北京博邁德基因技術有限公司;氨芐青霉素、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉和瓊脂糖均購自上海生工生物有限公司;胎牛血清(FBS)購自Cell Max公司;DMEM/F12培養基購自Hyclone公司;雙抗(青霉素、鏈霉素)、PBS均購自金克隆公司、0.25%胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司;Cytoplasmic &Nuclear RNA Purification Kit 購自英國NORGREN公司。

1.3 引物設計

根據NCBI中牛FABP4及U6、β-actin和GAPDH的基因序列,利用Primer 5.0設計PCR和qRT-PCR特異性引物(表1),委托陜西中科羽瞳生物公司合成。

表1 基因引物序列Tab.1 Primer sequences of gene

1.4 RNA的提取與cDNA的合成

按照TRIzol法提取奶牛不同組織總RNA。利用試劑盒提取BMECs的細胞核RNA和細胞質RNA。使用紫外可見光分光光度計(Eppendorf BioSpectrometer basic)進行濃度和純度檢測,利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行總RNA完整性檢測。挑取完整性及純度較好的不同組織的RNA利用諾唯贊生物公司反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNAs,反轉完成后置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.5 FABP4基因CDS區擴增與測序

通過PCR擴增出FABP4基因CDS區全長。FABP4基因擴增體系為25 μL(統一為250 ng/μL):cDNA樣品1 μL,上、下游引物各1 μL(10 μmol/L),TaqPCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序為:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸2 min,共30個循環;72 ℃終延伸6 min,4 ℃保存。對產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,用膠回收試劑盒進行回收目的片段,隨后將目的片段與pMD18-T Vector Cloning Kit克隆載體在4 ℃條件下過夜連接。將產物轉化到DH5α感受態細胞中,置于冰上30 min,42 ℃水浴90 s,再次置于冰上3 min,加入無抗液體LB培養基,37 ℃振蕩培養45 min,涂布于含氨芐抗性的LB平板培養基上,37 ℃倒置培養過夜,挑取單菌落放入含氨芐抗性的LB液體培養基,37 ℃搖床振蕩培養8 h,進行菌液PCR擴增。同時,收集菌液送至上海生工進行測序。

1.6 生物信息學分析

利用生物信息學軟件對牛FABP4基因進行分析,主要包括蛋白跨膜結構域、信號肽、亞細胞定位、蛋白質二、三級結構定位等,具體軟件使用的網址及預測的功能見表2。

表2 生物信息學分析軟件及功能Tab.2 Bioinformatics analysis software and functions

1.7 統計與分析

以GAPDH為內參基因,通過2-ΔΔCt法計算FABP4基因在奶牛各組織中的相對表達量。核質定位采用細胞核RNA中基因占比(%)=2^-胞核CT值/(2^-胞漿CT值+2^-胞核CT值),細胞質RNA中基因占比(%)=1-細胞核RNA中基因占比(%),原始數據結果通過Microsoft office 2019整理后利用SAS 9.2(SAS Institute,Cary,NC,美國)的線性混合模型(Linear mixedmodel)進行單因素方差分析,P<0.05認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 牛FABP4基因CDS序列擴增結果

以荷斯坦奶牛乳腺組織cDNA為模板,擴增FABP4基因CDS序列,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,結果如圖1所示,擴增出468 bp的清晰條帶,與預期條帶相符,可進行下一步研究。

圖1 荷斯坦奶牛FABP4基因CDS序列PCR擴增電泳結果Fig.1 Results of PCR amplification electrophoresis of CDS sequence of FABP4 gene in Holstein cows

2.2 牛FABP4基因片段克隆及測序結果分析

經菌液PCR鑒定成功獲得468 bp的目的片段(圖2-A)。將菌液測序結果與NCBI發布的牛FABP4基因序列進行比對,得到單峰全長為399 bp的CDS區序列(圖2-B),比對結果顯示(圖2-C)荷斯坦奶牛基因CDS序列第149位核苷酸存在錯義突變(T→G),使絲氨酸突變為丙氨酸。

A.PCR擴增產物鑒定;B.測序峰圖;C.測序序列比對。A.PCR amplification product identification;B.Sequencing peak map; C.Sequencing sequence comparison.

2.3 荷斯坦奶牛FABP4蛋白生物信息學分析

2.3.1 荷斯坦奶牛FABP4蛋白的功能分析 通過ProtParam在線網站分析FABP4蛋白的氨基酸組成成分,結果顯示,荷斯坦牛FABP4基因共編碼133個氨基酸殘基,蛋白分子式為C646H1043N171O201S8,分子質量為14.677 89 ku,其中含量最高的氨基酸為纈氨酸(占11.4 %),含量最低的氨基酸為半胱氨酸(1.5%)、脯氨酸(1.5%)、色氨酸(1.5%)、酪氨酸(1.5 %)。FABP4蛋白理論等電點(PI)為5.52,蛋白不穩定指數為15.92,是穩定蛋白。用ProtScale程序對牛FABP4蛋白進行疏水性分析,結果如圖3-A所示,FABP4蛋白第46位天冬酰胺疏水性最強為1.789,第76位脯氨酸親水性最弱為-2.244,親水性的總體平均值為-0.183,預測該蛋白為親水性蛋白。利用TMHMM 2.0在線軟件預測荷斯坦牛FABP4蛋白的跨膜結構,結果表明,利用SignalP 6.0程序預測FABP4蛋白的信號肽(圖3-B),發現該蛋白可能不存在信號肽序列,有較大可能為非分泌型蛋白。該蛋白不含跨膜區,且蛋白全部在膜外(圖3-C)。運用NetPhos 3.1Server程序對FABP4蛋白磷酸化位點進行預測,結果發現(圖3-D),荷斯坦牛FABP4氨基酸序列共有21個磷酸化位點,包括8個絲氨酸、11個蘇氨酸及2個酪氨酸,其中蘇氨酸在氨基酸序列中均廣泛分布。

圖3 牛FABP4親疏水性(A)、蛋白信號肽(B)、跨膜結構域(C)、磷酸化位點(D)預測結果Fig.3 Predicted results of bovine FABP4 hydrophobicity(A),protein signal peptide(B),transmembrane structural domain(C),and phosphorylation site(D)

2.3.2 荷斯坦奶牛FABP4蛋白空間結構預測 蛋白質二級結構主要指多肽鏈主鏈骨架中局部的構象,對其進行預測分析有助于認識蛋白的空間結構。本研究使用SOPMA軟件預測牛FABP4的二級結構,結果表明(圖4-A),由4種結構組成,其中包括無規卷曲(占25.00%)、α-螺旋(占28.03%)、β-折疊(占36.36%)、β-轉角(占10.61%)。通過SWISS對FABP4的三級結構進行預測分析,結果顯示,其組成部分與二級結構預測相符(圖4-B)。

藍色線條.α-螺旋;紅色線條.β-折疊;紫色線條.無規則卷曲;綠色線條.β-轉角。 Blue line. α-helix; Red line. β-sheet; Purple line. Random curl; Green line. β-turn.

2.3.3 FABP4的亞細胞定位 細胞可以分成多個細胞器或者細胞區域,如細胞膜、細胞質、細胞核、線粒體和高爾基體等,這些細胞器被稱為“亞細胞”。把確定某種蛋白質或表達產物在亞細胞位置的過程稱為蛋白質亞細胞定位。對于蛋白質功能研究而言,亞細胞定位是非常重要的分析內容,蛋白質在細胞中是流動的,所以一個蛋白可以具有一個到多個亞細胞定位信息。本研究通過Euk-mPLOC 2.0、YLoc和MultiLoc2等在線軟件預測了FABP4蛋白的亞細胞定位。如表3所示,預測結構表明,FABP4基因主要在細胞質中發揮重要功能。

表3 FABP4的亞細胞定位預測Tab.3 Predicted subcellular localization of FABP4 %

為了進一步驗證預測結果的真實性,分別提取了奶牛乳腺上皮細胞的細胞核RNA和細胞質RNA,通過qRT-PCR檢測(圖5),發現U6在細胞核中的含量接近60%,內參基因GAPDH和β-actin、FABP4在細胞質中的含量均為80%以上,上述結果表明,細胞核RNA和細胞質RNA分離成功。此外,結果顯示,FABP4在細胞質中的含量達80%以上,說明FABP4基因主要分布在細胞質,推測FABP4在細胞質中可能發揮重要功能。

圖5 FABP4在BMECs中的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of FABP4 in BMECs

2.3.4 荷斯坦奶牛FABP4核心啟動子預測 啟動子是位于結構基因5′端上游的一段核苷酸序列,是RNA聚合酶識別并與模板DNA特異性結合的部位,保證轉錄起始的精準性。因此,深入細致地研究啟動子,對于了解包括FABP4基因在內的各種基因的結構及其表達調控等具有重要意義。

本試驗選取基因轉錄起始位點ATG上游2 000 bp作為FABP4基因的啟動子,利用BDGP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)在線軟件進行啟動子預測(圖6),結果顯示,共預測到FABP4基因有4個核心啟動子區,分別位于FABP4基因上游732～782 bp,1 148～1 198 bp,1 246～1 296 bp,1 710～1 760 bp。

圖6 FABP4核心啟動子區域預測結果Fig.6 FABP4 core promoter region prediction results

2.3.5 FABP4蛋白的同源比對及系統進化樹構建 利用MegAlign對多個物種FABP4氨基酸序列進行同源比對分析,結果顯示(圖7),牛FABP4與綿羊、山羊、小鼠、人、大鼠、豬、馬、雞和斑馬魚的相似性分別為93.2%,92.4%,85.6%,84.1%,83.3%,81.8%,78.8%,72.0%和47.7%,其中與斑馬魚的相似性最低僅有47.7%,與其他幾個物種有較高的相似性。使用MEGA 11構建FABP4氨基酸序列在不同物種中的遺傳進化樹,結果表明(圖8),牛與綿羊和山羊之間的親緣關系最近,與雞和斑馬魚的親緣關系較遠。以上研究說明,FABP4基因編碼區在物種間比較保守。

圖7 牛與不同物種FABP4氨基酸序列同源性比對Fig.7 Comparison of amino acid sequence homology between bovine and different species of FABP4

圖8 FABP4氨基酸序列的系統進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of FABP4 amino acid sequences

2.3.6 牛FABP4蛋白互作預測分析及共轉錄因子預測 通過STRING數據庫分析FABP4蛋白與其他蛋白之間的關系,結果如圖9-A所示,蛋白互作網絡圖中各有10個節點,置信度為0.7(高等),線的粗細表示了數據支撐的強度。從圖9-A可以看出, FABP4蛋白與多個脂代謝相關蛋白(FABP1、LEP、FABP6、LIPE、LPL、PPARG、GOT2、FABP3、ADIPOQ、FABP7)存在較強的互作關系,推測可能在調控乳脂代謝方面扮演著重要的角色。利用CHEA3數據庫對以上11個基因進行共轉錄因子預測,結果如圖9-B所示,展示了對FABP4蛋白互作網絡中的基因預測的共轉錄因子之間相互調控的結果,根據ENCODE ChIP-seq展示了排名前十的轉錄因子(圖9-C)。

圖9 FABP4蛋白互作、共轉錄因子預測結果Fig.9 FABP4 protein interactions,co-transcription factor prediction results

2.4 FABP4在泌乳中期荷斯坦奶牛不同組織間的表達分析

qRT-PCR結果顯示(圖10),FABP4在7個組織中均有表達,以小腸組織作為對照,FABP4在乳腺組織中表達水平最高,與其他組織差異顯著,其他組織之間的表達量差異不顯著,提示FABP4在乳腺組織中發揮重要作用。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The difference lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).

3 結論與討論

作為脂質伴侶的FABPs,其功能大多的研究集中在3個主要的方面,一是在大多數細胞中其含量與FA代謝率呈正比[10],它可以主動促進脂質運輸到細胞的特定區域。其次,FABPs參與蛋白質-蛋白質的相互作用,包括膜和細胞內蛋白的相互作用[11]。第三,FABPs通過將脂質運輸到核受體,例如過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-ac-tivated receptor,PPAR)來介導某些轉錄因子的活性,從而參與組織和細胞中脂質傳感和反應機制的調節[12]。牛的FABP4由133個氨基酸組成,在6—32個氨基酸,包含一個結構域脂質運載蛋白,它能運輸小的疏水性分子,如脂質、類維生素A、類固醇激素和膽汁素等[13-14]。FABP4蛋白主要存在于脂肪細胞和巨噬細胞中,負責脂肪組織對脂肪酸的吸收和儲存,通過調節負責脂質代謝基因的表達,對維持正常代謝和機體的能力平衡發揮重要作用[15]。

本研究以荷斯坦奶牛FABP4為研究目標,克隆了荷斯坦奶牛FABP4基因的CDS序列,與NCBI已公布的序列比對后,發現FABP4基因序列存在一個突變位點,使得氨基酸序列、蛋白二、三級結構發生改變。改變后二級結構中無規卷曲和α-螺旋結構占比增加、β-折疊和β-轉角占比減少。無規則卷曲結構是蛋白肽鏈中構成配體、受體結合的組成部分,會受側鏈的影響改變其空間結構[16],進一步改變了FABP4蛋白的功能。對荷斯坦奶牛蛋白跨膜結構及信號肽進行預測分析,結果顯示,FABP4蛋白無跨膜結構域和信號肽剪切位點,表明其可能不是分泌蛋白。分析FABP4氨基酸序列及遺傳進化樹分析發現,牛與綿羊和山羊之間的氨基酸序列相似性均90%以上,親緣關系也最近,而與雞和斑馬魚的親緣關系較遠,FABP4發育樹與生物進化的物種樹基本一致,表明FABP4基因編碼區在物種間比較保守。這與石鵬飛等[17]的分析結果一致。FABP4亞細胞定位結果與在線軟件預測結果一致,表明FABP4基因可能主要在細胞質中發揮重要功能。而Yonekura等[18]對2種基因型的FABP4進行了核定位,研究結果存在差異,他們認為FABP4的核定位存在基因型依賴性差異,即FABP4V/V和I/I的核定位不同,造成這一原因是因為細胞內轉錄因子配體與FABP4的脂肪酸結合袋的結合會導致含核轉運信號區域發生輕微改變,從而使FABP4進入細胞核內,故FABP4的亞細胞定位還需要用更多的試驗研究去證實。利用STRING預測發現,FABP4蛋白與FABP1、LEP、FABP6和PPARG等10種蛋白存在較強的互作關系,其中FABP1能夠激活PPARα,啟動靶基因的轉錄,活化后的PPARα可正反饋調節FABP1,使FABP1表達量增加[19-20]。FABP3已被證明是與家畜肌內脂肪(Intramuscular fat,IMF)含量相關的候選基因[20-21]。Wei等[22]的研究表明,FABP4通過調節脂質代謝相關基因(如ADIPOQ、LEP和LEPR)在脂肪沉積和代謝綜合征中起作用。Bao等[23]通過綜合轉錄組的研究發現,受lncRNA調控的LIPE、ADIPOQ等可能通過AMPK信號通路使藏羊肌內脂肪沉積含量降低。以上研究均表明,與FABP4互作的蛋白是與脂質代謝密切相關的蛋白,進一步推測FABP4在奶牛乳脂代謝中也發揮著關鍵的作用。共轉錄因子預測到SREBP1轉錄因子參與到FABP4基因的表達,與Li等[24]的研究結果一致,SREBP1可能是調控牛FABP4基因表達的重要轉錄因子。qRT-PCR結果表明,FABP4基因在泌乳中期的荷斯坦奶牛各個組織中均有不同程度的表達,FABP4在乳腺組織中高表達,顯著高于其他組織(小腸、肝臟、心臟、子宮、腎臟、卵巢),其他組織之間差異不顯著。在肝臟組織中的表達量最低,幾乎可以忽略,這與Attal等[25]的研究結果一致,FABP4通常不在肝臟中表達。Marchitelli等[8]的研究發現,FABP4對長鏈脂肪酸有正調控,對中鏈脂肪酸有負調控,并表明FABP4是影響乳脂組成最重要的基因。Zhou等[26]的研究表明,FABP4影響奶牛的產奶量和乳蛋白的含量。這暗示了FABP4在奶牛泌乳過程中發揮著重要的調控作用。

本研究利用荷斯坦奶牛乳腺組織,克隆了FABP4基因的CDS區。對FABP4基因及編碼蛋白進行了生物信息學分析,并通過對泌乳中期荷斯坦奶牛不同組織表達譜的分析,表明FABP4基因在乳腺組織中高表達。本研究為后續深入研究荷斯坦奶牛FABP4的生物學功能及乳脂調控機制提供了理論基礎。