北京市通州區即食非發酵豆制品微生物污染狀況及致病菌分析

趙鳳玲，李盼盼，高 翔，羅宇馨，王潤萍，高 靜

（1.北京市通州區疾病預防控制中心，北京 101100；2.河北北方學院，河北張家口 075000）

大豆及其制品的蛋白質含量居植物蛋白之首，有防癌、護肝、降血壓、增強免疫力等保健作用[1]，其含有的大豆異黃酮和大豆皂苷在治療動脈粥樣硬化、冠心病、抗腫瘤等方面有積極的效果[2]，越來越受到消費者推崇。但豆制品中所含豐富營養物質又為微生物提供了理想的生長條件，如果保存不當受到微生物的污染很容易大量增殖，會給消費者的健康帶來極大的威脅[3]。即食非發酵豆制品日常消費量很大，包括豆腐、豆漿、豆絲、豆干、涼拌菜等，因為其直接入口的特點，致病微生物的污染會對消費者的健康造成極大的傷害。本研究基于2020 年底對北京市通州區開展的一次即食非發酵豆制品的微生物污染狀況監測，分析了北京市通州區不同包裝、不同采樣場所即食非發酵豆制品微生物污染情況，以期為當地食源性疾病的風險評估提供依據。

1 材料與方法

1.1 即食非發酵豆制品樣品采集

利用無菌操作技術在北京市通州區大型超市、農貿市場、網店采集即食非發酵豆制品共70 份，采樣量≥250 g/份，大型超市30 份，農貿市場30 份，網店10 份，其中散裝45 份、預包裝25 份，采樣后立即低溫運送至實驗室檢測。

1.2 材料與儀器

革蘭陽性/陰性需氧菌藥敏檢測板（上海星佰）；沙門氏菌診斷血清（丹麥SSI）；單增李斯特菌血清分型抗體（日本DenkaSeiken）；致瀉大腸埃希氏菌核酸檢測試劑盒（北京良潤）；單核細胞增生李斯特氏菌毒力基因和分型引物，由上海生工合成；AscI和Xba Ⅰ限制性核酸內切酶（TAKARA）。

電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；VITEK2 COMPACT30 全自動細菌生化分析系統（法國生物梅里埃公司）；普通PCR 儀（美國BIO-RAD 公司）；羅氏實時熒光定量PCR 儀（Roche Diagnostics Ltd）；全自動DNA/RNA 分析系統（QIAGEN）；脈沖場凝膠電泳儀及凝膠成像分析系統（美國BIO-RAD 公司）。

1.3 同時期參比致病菌株

2020 年6 月—12 月北京市通州區食源性疾病腹瀉病例中分離的沙門氏菌；2018—2020 年北京市通州區單核細胞增生李斯特氏菌病例監測中分離的菌株；2020 年6 月—12 月北京市通州區食源性疾病腹瀉病例中分離的致瀉大腸埃希氏菌。

1.4 檢測項目和方法

檢驗項目為菌落總數、大腸菌群計數、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌和致瀉大腸埃希氏菌，均按GB 4789 系列標準[4-9]進行檢測。致病菌鑒定均用全自動細菌生化分析系統VITEK2 COMPACT30。

1.5 致病菌分離株的分析方法

利用血清凝集方法測定血清型；用微量肉湯稀釋法進行藥敏分析；用PCR 方法分析毒力基因；參考國家致病菌識別網技術規范將豆制品中分離的菌株與同時期通州區食源性疾病腹瀉病例中分離的同類菌株進行PFGE 分子分型。

1.6 結果判定

1.6.1 評價標準

參照《 食品安全國家標準 面筋制品》（GB 2711—2014）[10]、《食品安全國家標準豆制品》（GB 2712—2014）[11]、《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[12]以及《食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[13]評價豆制品微生物污染情況；數據統計應用SPSS 24.0 軟件，計數資料均用率表示，卡方檢驗，當P＜0.05 時，表示差異具有統計學意義。

1.6.2 藥物敏感性

根據美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的相應標準評價致病菌的藥敏結果，獲得相應敏感（S）、中度敏感（I）和耐藥（R）的結果。

1.6.3 PFGE 圖譜

用Bionumerics 7.6 軟件分析菌株間的親緣性，采用非加權配對平均法，位置容許度為1.5%。

2 結果與分析

2.1 即食非發酵豆制品的微生物檢測情況

樣品共計70 份，總合格率38.57%（27/70），菌落總數合格率38.57%（27/70），大腸菌群合格率85.71%（60/70）。致病菌檢出率20.00%（14/70），其中5 株沙門氏菌（7.14%），4 株單核細胞增生李斯特菌（5.71%），5 株致瀉大腸埃希氏菌（7.14%）。

2.2 不同包裝即食非發酵豆制品的檢測情況

預包裝菌落總數合格率顯著高于散裝樣品（χ2=18.341，P＜0.05）；預包裝大腸菌群合格率稍高于散裝樣品（χ2=2.180，P＞0.05）；預包裝致病菌檢出率顯著低于散裝樣品（χ2=6.222，P＜0.05），具體數據見表1。

表1 不同包裝即食非發酵豆制品的微生物指標檢測結果

2.3 不同采樣場所即食非發酵豆制品的檢測情況

3 類采樣場所樣品的合格率分別為農貿市場20.00%、超市56.67%、網店40.00%，差異有統計學意義（χ2=8.520，P＜0.05），見表2。

表2 不同采樣場所即食非發酵豆制品的檢測情況

2.4 致病菌分離結果

2.4.1 沙門氏菌

（1）血清分型。5 株沙門氏菌中2 株為鼠傷寒沙門氏菌，1 株為腸炎沙門氏菌，1 株為阿姆斯特丹沙門氏菌，1 株為德爾卑沙門氏菌。

（2）耐藥情況。受試的15 種抗生素中，所有菌株對亞胺培南、頭孢西丁、慶大霉素、阿奇霉素和環丙沙星的敏感率為100%，對氨芐西林、氨芐舒等呈現不同程度的耐藥性，見表3。

表3 沙門氏菌菌株耐藥情況

（3）PFGE 分型。將豆制品中分離沙門菌株及同時期腹瀉病例分離沙門菌株進行PFGE 分析，菌株間條帶相似度介于57.3%～100.0%，來源于市場的3號豆制品的菌株與來源于病例的2、3、4、5 號菌株帶型相似度為88.7%，來源于市場的1 號豆制品的菌株與來源于病例的1 號菌株帶型相似度達77.4%，見圖1。

圖1 沙門氏菌PFGE 圖

2.4.2 單核細胞增生李斯特菌

（1）毒力基因及血清分型。分離出的4 株單核細胞增生李斯特氏菌，3 株血清型為1/2a，1 株血清型為1/2b，所有菌株6 對毒力基因（prfA、plcA、iap、hly、plcB、inlA）均為陽性。

（2）耐藥情況。單核細胞增生李斯特氏菌在受試的15種抗生素中，對多數抗生素敏感，但對苯唑西林、環丙沙星、頭孢西丁100%耐藥，見表4。

表4 單核細胞增生李斯特氏菌菌株耐藥情況

（3）PFGE 分型。將豆制品分離株及近3 年病例檢測出的菌株進行PFGE 分析，菌株間條帶相似度介于56.9%～90.9%。來源于豆制品的3 號帶型與來源于病例的6 號帶型只相差2 個條帶，相似度達90.9%，與7 號帶型相差3 個條帶，相似度達86.4%；來源于豆制品的2 號帶型與來源于病例的5號帶型相差4 個條帶，相似度達80.0%，見圖2。

圖2 單核細胞增生李斯特氏菌PFGE 圖

2.4.3 致瀉大腸埃希氏菌

（1）毒力基因及血清分型。5 株致瀉大腸埃希氏菌均攜帶astA 毒力基因，為腸聚集性大腸埃希菌（Enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）。

（2）耐藥情況。受試的15 種抗生素中，5 株致瀉大腸埃希氏菌對頭孢他啶、氨芐舒、亞胺培南、頭孢西丁、頭孢噻肟、慶大霉素、阿奇霉素的敏感率為100%，對頭孢唑林和環丙沙星的敏感率為80%，對四環素和復方磺胺呈現不同程度的耐藥，見表5。

表5 致瀉大腸埃希氏菌菌株耐藥情況

（3）PFGE 分型。將豆制品5 株致瀉大腸埃希氏菌分離菌株及同時期腹瀉病例致瀉大腸埃希氏菌分離菌株進行PFGE 分析，菌株間條帶相似度介于62.5%～77.3%，來源于豆制品的菌株與同期病例菌株未見較近的親緣關系，見圖3。

圖3 致瀉大腸埃希氏菌PFGE 圖

3 討論

3.1 總體情況

此次檢測非發酵性即食豆制品共計70 份，合格率僅為38.57%，表明北京市通州區非發酵性即食豆制品衛生質量不容樂觀。這與呂秋艷等[14]在北京市門頭溝區非發酵豆制品微生物污染調查分析中的合格率25%相比較高，與劉曉娟[15]在邯鄲市非發酵豆制品微生物污染調查分析中的合格率39.16%結果相近。菌落總數合格率僅38.57%，說明產品在加工、運輸、儲存和售賣等環節均可能有微生物污染。并且檢出14 株致病菌，表明非發酵即食豆制品有引起食物中毒的潛在危險。

3.2 散裝和預包裝

預包裝豆制品合格率為72.00%，遠遠高于散裝豆制品的20.00%，與雷少華[16]的研究結果相一致。衛生指標菌（菌落總數和大腸菌群）散裝樣品合格率僅為20.00%，而預包裝產品合格率72.00%，提示散裝產品在加工、運輸、儲存、售賣等各個環節中更容易受到微生物的污染。特別是檢出的14 株致病菌，有13 株來自散裝豆制品，致病菌檢出率為28.89%，說明散裝即食非發酵豆制品存在很大的食品安全隱患。為了保障食品安全，應該進一步研究探討微生物污染的來源，采取相應的控制措施，提高產品的衛生合格率。也提示產品包裝是防止微生物污染的有效手段，為相關部門對豆制品的安全管理提供依據。

3.3 銷售場所

不同銷售場所菌落總數合格率分別為超市56.67%、網店40.00%、農貿市場20.00%。超市的合格率最高，這可能是因為超市對于產品質量把控嚴格，進貨渠道正規，儲存條件適宜；合格率最低的是農貿市場，這可能與農貿市場衛生狀況較差，沒有良好的防塵、防蠅措施以及冷藏條件有關；網店是新興事物，還缺乏相關的管理規范，衛生條件良莠不齊，總體合格率也不高。此外農貿市場樣品致病菌檢出率最高，劉琴等[17]的研究表明沙門氏菌等致病菌的污染在一定程度上是由農貿市場較差的衛生條件所致，提示衛生管理部門應對農貿市場衛生條件較差的小攤位加強監督管理，堅決取締不合格的經營攤點。此外應盡快出臺對網店的監管措施，做好食品安全工作，保證消費者的身體健康。

3.4 致病菌情況

（1）沙門氏菌。在分離出的沙門氏菌中，有2 株鼠傷寒沙門氏菌，1 株腸炎沙門氏菌，調查顯示鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌是導致人群感染沙門氏菌病的主要血清型[18]，這些沙門氏菌對氨芐西林、頭孢唑林等呈現不同程度耐藥性。在PFGE 聚類分析中，來源于市場的3 號豆制品PFGE 條帶與來源于病例的2、3、4、5 號條帶相似度為88.7%，表明為同一克隆群，因缺少病例流行病學資料未能成功溯源，但提示該豆制品可能為沙門氏菌感染性腹瀉相關的風險食品。

（2）單核細胞增生李斯特氏菌。資料顯示，在單核細胞增生李斯特氏菌中，常見的能夠致病的血清型為1/2a、1/2b 和4b[19]。本研究中分離出的單核細胞增生李斯特氏菌中，3 株血清型為1/2a，1 株血清型為1/2b，是常見致病血清型。此外，單核細胞增生李斯特氏菌致病性與毒力基因密切相關，prfA 是調控基因，缺失后會使單增菌毒力喪失[20]，plcB 產生磷脂酰膽堿磷脂酶促進細菌在宿主間的擴散[21]，inlA 是內化素基因與細菌的侵襲力有關[22]，iap 產生p60 蛋白[23]，hiy 產生溶血素，plcA 基因編碼一個特異作用于磷脂酰肌的磷脂酶，它主要協同plcB 發揮作用[24]，本次檢測所有單核細胞增生李斯特氏菌6 對毒力基因均為陽性。在PFGE 聚類分析中，有病例菌株和農貿市場豆制品菌株條帶相似度達90%以上，說明可能是同一克隆來源的菌株，且致病的單核細胞增生李斯特氏菌可能在本地區長期存在，散裝即食豆制品是風險食品。

（3）致瀉大腸埃希氏菌。在分離的大腸埃希氏菌中，所有菌株均攜帶astA 毒力基因為EAEC，與李梅基等[25]調查的優勢菌株類型和毒力基因一致。在伊朗、巴西兒童腹瀉病例致瀉大腸埃希氏菌的研究中，EAEC 的檢出率居首位[26]。豆制品分離出的EAEC 對復方磺胺和四環素耐藥，這為今后臨床治療兒童腹瀉病例提供了方向。

4 結論

北京市通州區即食非發酵豆制品污染較為嚴重，將檢出的食源性致病菌和病例菌株進行比對分析，發現存在食品安全隱患；網店作為新興購物渠道，國內外還未見有即食非發酵豆制品網店樣本的相關報道，本研究做了初步的探索，發現與超市、農貿市場等常規采樣場所對比，樣品檢驗合格率處于居中水平，但整體合格率較低。本次即食非發酵豆制品的采樣量比較小，分析還不夠透徹，且沒有分析季節變化對污染狀況的影響，后續應繼續完善相關研究數據。