高效液相色譜法同時測定糕點中的苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸

黃 程，葉小萱，董紅兵

（武漢商學院 食品科技學院，湖北武漢 430056）

糕點是人們生活中的一款常見食品，主要以谷類、薯類、豆類、油脂、糖和蛋等中的一種或多種為原料，按需添加其他輔料，經過調制、成型、熟制等工藝制作而成，深受消費者喜愛[1]。在糕點的制作過程中，為了延長其貨架期，人們可能會添加食品防腐劑，以增加糕點的商業價值[2]。目前，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸等防腐劑的使用在食品中屢見不鮮[3]。防腐劑主要是通過抑制食品中微生物的生長與繁殖達到防腐效果。苯甲酸是人們使用較早的一類酸性食品防腐劑，使用歷史較長，過量攝入會影響人體血壓、心臟、腎臟功能。研究表明，對大鼠肝腎多次給藥苯甲酸鈉，對肝臟造成了一定的損害[4-8]。山梨酸是很多國家的首選防腐劑，具有超高的安全性，但是過量攝入會對人體產生不良影響[9]。脫氫乙酸是一種廣譜高效的食品防腐劑，受到各類食品企業的普遍歡迎，被廣泛應用于奶油、面包、蛋糕等糕點中[10-11]。

目前，對苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸檢測方法的研究很多，但以乙醇-水溶液作為提取溶劑，結合液相色譜測定的方法研究較少[12-15]。苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的檢測主要采用《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）[16]和《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）[17]中規定的方法。檢測一份樣品中不同防腐劑的含量需分開檢測，增加了工作量，加大了工作難度，降低了檢測效率，且成本普遍較高，因此建立一種可以同時檢測多種防腐劑的方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糕點樣品購買于本地超市。苯甲酸（99.66%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司）；山梨酸（99.18%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司）；脫氫乙酸（上海安普實驗科技股份有限公司）；甲醇（色譜級，德國merck 公司）；乙酸銨（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅和氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.2 儀器與設備

Waters2695 高效液相色譜儀，美國Waters 公司；TGL-205 離心機，湖南平凡科技有限公司；KQ-250B 型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；電子分析天平，上海越平科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

稱取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸標準物質各20 mg 于10 mL 容量瓶中，加入少量無水乙醇溶解后，定容至10 mL 刻度線處，配制成濃度為2 000 μg·mL-1的標準儲備溶液。分別移取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸標準儲備溶液1 mL 于10 mL 容量瓶中，以無水乙醇定容，配制成濃度為200 μg·mL-1的混合標準溶液。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取2 g 粉碎均勻的樣品放入離心管中，加入20 mL 提取溶劑，渦旋混勻，50 ℃超聲提取20 min，冷卻至室溫，10 000 r·min-1離心10 min，上清液經0.45 μm 微孔濾膜過濾，備用。

1.3.3 色譜條件

色 譜 柱：Acclaim 120A C18色 譜 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30.0 ℃；流動相：甲醇+20 mmol·L-1乙酸銨溶液=13 ∶87（V∶V）；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：230 nm。

1.3.4 提取溶液的選擇

準確稱取空白樣品2 g 于50 mL 離心管中，分別添加10 μg、20 μg、40 μ（gn=3）的混合標準溶液，振蕩混勻，加入20 mL 乙醇-水溶液（乙醇濃度為0%、20%、40%、50%、60%和80%，V∶V），渦旋混勻，50 ℃超聲提取20 min，冷卻至室溫，10 000 r·min-1離心10 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾上清液，得待測液。高效液相色譜測定待測液中的防腐劑，計算3 種防腐劑的回收率。

1.3.5 方法驗證

①測定線性范圍及檢出限。將苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸混合標準溶液配制成0.2 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、25.0 μg·mL-1和50.0 μg·mL-1的系列標準溶液，按1.3.3色譜條件進樣分析，以3 種防腐劑的質量濃度為橫坐標，峰面積大小為縱坐標，繪制標準曲線。②加標回收試驗。取空白糕點樣品18 份，每份約2 g，分別添加10 μg、20 μg、40 μg（n=3）的混合標準溶液，加入20 mL 1.3.4 確定的提取溶液，按1.3.2 樣品前處理方法處理樣品，進行加標回收試驗，計算各組分的回收率和相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。③精密度試驗。質量濃度為1.0 μg·mL-1的混合標準溶液連續重復進樣6 次。

2 結果與分析

2.1 提取溶液的選擇結果

由圖1 知，3 個添加水平下，當提取溶液中乙醇濃度逐漸升高時，苯甲酸和山梨酸的回收率均較高且相差不大；在100%乙醇作為萃取溶劑時，回收率下降明顯。脫氫乙酸在乙醇含量高于50%時，回收率開始下降，隨提取液中乙醇濃度的提高不斷下降，尤其是在10 μg 加標濃度下。且當提取液中乙醇含量超過60%時，脫氫乙酸的色譜峰由尖峰變為駝峰，本方法提取溶劑中乙醇比例對脫氫乙酸影響較大。綜合考慮，選擇40%乙醇溶液，即40%的乙醇-水溶液作為提取溶劑。

圖1 不同比例乙醇-水溶液對3 種防腐劑的提取回收率

2.2 方法驗證結果

2.2.1 線性范圍及檢出限

苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸在0.20 ～50.33 μg·mL-1線性良好，相關系數＞0.999。以S/N=3 計算檢出限，以S/N=10 計算定量限，當取樣量為2 g 時，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的最低檢出限為0.161 mg·kg-1、0.160 mg·kg-1、0.160 mg·kg-1，定量限為0.403 mg·kg-1、0.400 mg·kg-1、0.399 mg·kg-1，詳細結果見表1。

表1 苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的線性范圍、檢出限、定量限

2.2.2 加標回收試驗結果

從表2 可看出，3 種防腐劑的平均回收率為93.16%～99.74%，相對標準偏差為0.50%～4.00%，表明方法回收率和重現性良好，結果準確可靠，誤差在可接受范圍之內。混合標準溶液色譜圖和空白樣品加標色譜圖如圖2 所示，3 種防腐劑出峰順序為苯甲酸、脫氫乙酸、山梨酸，保留時間在7.3 min、8.9 min、9.7 min 左右，3 種防腐劑色譜峰峰形良好，峰形尖銳對稱，可完全分離，且樣品中雜質對色譜峰無干擾。

表2 苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸回收率和相對標準偏差（n=6）

圖2 混合標準溶液及空白樣品加標色譜圖

2.2.3 精密度試驗

由表3 可知，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的RSD 為0.51%、0.21%和0.59%，具有良好的精密度。

表3 苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸精密度

2.3 樣品的測定結果

用建立的方法測定市場銷售的5 批次糕點中3種防腐劑的含量，并與國家標準方法進行對比，結果見表4。本實驗方法所測定的實際樣品中的防腐劑含量與國標方法測定樣品中防腐劑含量基本相符，本實驗方法的結果可靠，適用于糕點中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸3 種常用防腐劑的同時檢測。

表4 本方法與國家標準方法測定樣品結果對比

3 結論

本研究選取乙醇-水溶液作為提取溶劑，利用高效液相色譜法建立了一種檢測糕點中多種食品防腐劑的方法，考察了該方法的線性范圍、檢出限、定量限、加標回收率和精密度等，將檢測結果與國家標準方法進行比較，結果表明該方法具有快速、簡便、高效的優點，是一種簡便、快捷、準確的檢測方法，可以為糕點中多種防腐劑的測定提供依據。

注：—代表未檢出。