探討基質效應、標曲定量方式對餐飲食品中5 種生物堿定量結果的影響

林曉明，許琨琨，蔡振世，莊秋虹，莊慶彬

（泉州市食品藥品檢驗所，福建泉州 362000）

以罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因等為主要成分[1]的罌粟殼中的多種生物堿可以讓食品增味提鮮，使顧客上癮，讓人嗜睡和性格改變，長期食用會引起精神失常，出現幻覺甚至慢性中毒[2-3]。盡管我國法律明令禁止在食品中添加罌粟殼，有關部門對在食品中添加罌粟殼的行為采取高壓打擊態勢，但某些不法商販，為了“回頭客”，利用罌粟殼的成癮特性，將其添加在羊肉湯、火鍋底料、麻辣燙等餐飲食品中，從而增加客流量，嚴重危害人們的身心健康[4-5]。

目前，在5 種生物堿的檢測中，相比以往固相萃取法、氯仿萃取法等前處理方法，QuEChERS 前處理方法更快速、便捷、有效，廣泛應用于多數檢測領域，也用于罌粟殼中多種生物堿的檢驗檢測[3,6-7]。筆者發現不同的標準曲線定量方式會直接影響最終的定量結果，基于此對基質效應和標曲定量方式對5 種生物堿中的影響展開研究探討，同時建立一種高效QuEChERS-UPLC-MS/MS 方法，一次性同時檢測羊湯、火鍋湯和水煮魚湯等多種餐飲食品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5 種生物堿含量，以供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

GM200 高 速 磨 碎 機，Retsch；XSE205DU 電子天平，梅特勒托利多儀器有限公司；LPD2500 多管旋渦混合儀，萊普特科學儀器（北京）有限公司；LAB DANCER S25 漩渦混勻器，艾卡（廣州）儀器設備有限公司；Tissuelyser-96LGM 多樣品組織研磨儀，上海凈信實業發展有限公司；3-15 離心機，曦瑪離心機（揚州）有限公司；TurboVap LV 全自動氮吹儀，Biotage；Triple Quad 5500 三重四極桿液質聯用系統，美國愛博才思公司。

1.2 材料與試劑

樣品：羊湯、火鍋湯、水煮魚湯，均在泉州市區各小吃店的餐飲食品隨機采購。

試劑：乙腈（默克，色譜純）；甲醇（默克，色譜純）；甲酸（ROE，色譜純）；乙酸銨（Fisher Chemical，色譜純）。鹽酸可待因（中檢院，批號：171203-201808，100 mg）；嗎啡（中檢院，批號：171201-201825，100 mg）；蒂巴因（中檢院，批號：171216-201805，50 mg）；那可丁（中檢院，批號：171224-201605，100 mg）；鹽酸罌粟堿（中檢院，批號：171214-201906，100 mg）；甲醇中可待因-D3 溶液（First Standard?，批號：S107027，100 μg·mL-1）； 甲 醇 中 嗎 啡-D3 溶 液（First Standard?，批號：S102043，100 μg·mL-1）。

材料：高效QuEChERS 樣品前處理試劑盒[青云化學科技有限公司，型號：CQ11-3（萃取管+鹽包+凈化管），批號：20230323-004]。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜和質譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH HILIC（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流 動 相：A 相為含0.1%甲酸的10 mmol·L-1乙酸銨溶液，B 相為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫（見表1）。柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：2 μL。

表1 梯度洗脫程序

（2）質譜條件。離子源：ES（I電噴霧離子源），正離子模式采集；掃描方式：多反應監測MRM；氣簾氣（CUR）：20 psi；離子化電壓（IS）：5 500 V（正離子模式）；溫度（TEM）：500 ℃；噴霧氣（GS1）：50 psi；輔助加熱氣（GS2）：50 psi；各化合物質譜參數見表2。

表2 5 種生物堿的質譜參數

1.3.2 對照品及樣品溶液的制備

（1）混合對照品溶液的制備。對照品儲備液：精密稱取嗎啡、鹽酸可待因（以下簡稱可待因）、蒂巴因、那可丁和鹽酸罌粟堿（以下簡稱罌粟堿）對照品適量，分別置于25 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成濃度均為100 μg·mL-1的對照品儲備液。

混合對照品溶液A：精密吸取嗎啡、可待因各1 000 μL 和那可丁、蒂巴因、罌粟堿各200 μL 于20 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，得嗎啡、可待因濃度為5 μg·mL-1和那可丁、蒂巴因、罌粟堿濃度為1 μg·mL-1的混合對照品溶液A。

混合對照品溶液B：精密吸取100 μL 混合對照品溶液A于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，得嗎啡、可待因濃度為50 ng·mL-1和那可丁、蒂巴因、罌粟堿濃度為10 ng·mL-1的混合對照品溶液B。

同位素內標混合對照品工作溶液（5 μg·mL-1）：精密吸取嗎啡-D3 和可待因-D3（對照品濃度均為100 μg·mL-1）各1 000 μL 置于20 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得嗎啡-D3 和可待因-D3 濃度均為5 μg·mL-1的混合內標溶液，備用。

混合標準工作液制備：以乙腈為溶劑，精密吸取混合對照品溶液B 適量，逐級稀釋成質量濃度 為0.20 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1的那可丁、蒂巴因、罌粟 堿 和 質 量 濃 度 為1.00 ng·mL-1、2.50 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1、10.00 ng·mL-1、25.00 ng·mL-1的嗎啡、可待因混合標準工作液，備用。

（2）樣品溶液的制備。每種樣品平行稱取2 g（精確至0.01 g），分別置于50 mL CQ11-3 萃取管（內含NaCl 500 mg）中，加入5 mL 水振搖混勻，再加入溶劑乙腈15 mL，渦旋振搖混勻1 min 左右，加入CQ11-3 鹽包（內含MgSO45 g 和NaAc 2 g），劇烈振蕩1 min，用5 000 r·min-1離心機離心5 min，取上清液8 mL 至CQ11-3 凈化管（內含PSA 300 mg、C18500 mg 和MgSO41 500 mg）中，渦旋混勻1 min 左右，再經5 000 r·min-1離心機離心5 min，移取上清液適量經0.22 μm 有機濾膜，按1.3.1 方法進樣。

（3）溶劑混合標準工作曲線制備。取5 支10 mL玻璃試管，均加入同位素內標混合對照品工作溶液（5 μg·mL-1）20 μL，再依次加入1 mL 相應質量濃度的混合標準工作液，復溶混勻（見表3），過0.22 μm有機濾膜，按1.3.1 方法進樣。

表3 溶劑/基質混合標準工作曲線中各化合物濃度梯度

（4）基質混合標準工作曲線的制備。稱取3 種空白基質樣品各2 g（精確至0.01 g），每種平行6 份。同樣品溶液的制備方法進行提取和凈化，得空白基質溶液，合并于50 mL 塑料離心管，再分別精確移取1 mL 置于5 支10 mL 玻璃試管中，40 ℃水浴中氮氣吹干，均加入同位素內標混合對照品工作溶液（5 μg·mL-1）20 μL，再依次加入1 mL 相應質量濃度的混合標準工作液，復溶混勻（見表3），過0.22 μm有機濾膜，按1.3.1 方法進樣。

（5）加標回收及精密度測試。稱取3 種空白基質樣品各2 g（精確至0.01 g），每種平行6 份。設置一個濃度水平加標回收，分別加入20 μL 混合對照品溶液A 和300 μL 同位素內標混合對照品工作溶液（5 μg·mL-1），同樣品溶液的制備方法進行提取和凈化，按1.3.1 方法進樣。

（6）檢出限、定量限的確定。利用空白基質添加5 種生物堿目標化合物，以3 倍信噪比對應檢測濃度確定方法檢出限，以10 倍信噪比對應的檢測濃度確定方法定量限。

2 結果與分析

2.1 標準工作曲線線性范圍

本實驗方法得出的各目標化合物的線性范圍如表4 所示，其中罌粟堿、那可丁、蒂巴因線性濃度范圍為0.20 ～5.00 ng·mL-1，嗎啡、可待因的線性濃度范圍為1.00 ～25.00 ng·mL-1，相關系數均在0.998 以上，說明各目標化合物的峰面積與進樣濃度在線性范圍內呈現良好的相關性。

表4 5 種生物堿的線性范圍定量分析

2.2 不同基質的基質效應分析

按公式（1）分析基質效應影響，結果如表5 所示。由表5 可知，用高效QuEChERS 方法處理空白基質，5 種生物堿均表現為基質抑制效應。其中，罌粟堿、那可丁、蒂巴因在外標法定量分析中，3 種基質中的|ME|≤0.22，基本呈現弱的基質效應；嗎啡、可待因在外標定量和內標法定量中，3 種基質中的|ME|均在0.2 ～0.5，呈現中等基質效應，同時可以發現內標法定量分析加大了這種效應趨勢。

表5 5 種生物堿在3 種基質中的基質效應

式中：ME為基質效應；A為基質標準曲線斜率；B為溶劑標準曲線斜率。當ME＞0，表明基質效應增強；ME＜0，表明基質效應抑制；|ME|=0表示不存在基質效應；|ME|＜0.2 為弱基質效應；0.2 ≤|ME|≤0.5 為中等基質效應；|ME|＞0.5 為強基質效應[6]。

2.3 不同標曲定量分析加標回收率

從表6 可知，用溶劑標曲外標法和基質標曲外標法定量分析罌粟堿、那可丁、蒂巴因在羊湯、火鍋湯、水煮魚湯中的加標回收率情況，回收率均能滿足實驗室質量控制規范，表明該高效QuEChERS前處理方法對罌粟堿、那可丁、蒂巴因3 種生物堿的提取效率較好。但可以發現基質標曲外標法定量相較于溶劑標曲外標法定量而言，回收率均有所上升，除了罌粟堿和那可丁在水煮魚湯基質加標中的上升幅度比較大，達到21%和27%，其余上升幅度均不超10%，影響相對有限。其中蒂巴因在火鍋湯基質加標中的上升幅度最低，僅有1%左右。這與2.2分析的基質效應抑制相對應，基質效應越弱，兩種標曲定量出來的回收率結果越接近，反之相差越大。由此可見，使用基質標曲外標法定量罌粟堿、那可丁、蒂巴因相對準確，但為了方便快捷，減少基質空白前處理過程，參考實驗室質量控制規范要求，由于罌粟堿、那可丁和蒂巴因基質效應偏弱，可以采取溶劑標曲外標法定量分析。

表6 不同標曲定量分析3 種基質中5 種生物堿的加標回收率、定量限、檢出限

用溶劑標曲外標法和基質標曲外標法定量分析嗎啡、可待因在羊湯、火鍋湯、水煮魚湯中的加標回收率情況，基質標曲外標法定量能讓回收率上升幅度在25%～55%，但回收率結果均不足50%，未能有效滿足實驗室質量控制規范。可見，即使嗎啡、可待因在3 種基質中的基質效應影響較大，呈現中等基質效應，用基質標曲外標法定量仍未能滿足要求。而用溶劑標曲內標法定量分析，嗎啡的回收率在82%～85%，可待因的回收率在85%～87%，均能滿足實驗室質量控制規范。這與嗎啡、可待因在高效QuEChERS 前處理過程中損失有著密切聯系。據此，筆者提出該前處理方法是影響嗎啡、可待因提取效率的第一影響因素，而基質效應為次影響因素。為此，采取了用基質標曲內標法定量分析了加標回收情況，結果是嗎啡回收率范圍在123%～149%，可待因的回收率范圍在140%～149%，這可能是嗎啡-D3、可待因-D3 內標物校正了QuEChERS 前處理過程中目標化合物的損失（含基質效應影響的部分）和基質標曲校正了基質效應影響的雙重疊加的結果，偏離了實驗室質量控制規范范圍。由此可以得出，QuEChERS 前處理方法是影響嗎啡、可待因提取效率的第一影響因素，基質標曲外標法定量對其改善不足，用溶劑標曲內標法定量分析較為可靠，也相對方便快捷。

2.4 方法學驗證的結果分析

按2.3 分析，本文針對罌粟堿、那可丁和蒂巴因選取溶劑標曲外標法定量分析，嗎啡、可待因選取溶劑標曲內標法定量分析，確定該方法的方法學參數的可靠性。從表4 可知，罌粟堿、那可丁、蒂巴因線性濃度范圍為0.20 ～5.00 ng·mL-1，嗎啡、可待因的線性濃度范圍為1.00 ～25.00 ng·mL-1，相關系數均在0.998 以上。從表6 可知，5 種生物堿在3 種基質中的定量限和檢出限均較低，在羊湯、火鍋湯、水煮魚湯中的定量限位于0.08 ～4.50 μg·kg-1，檢出限位于0.02 ～1.35 μg·kg-1。從表7 可知，5 種生物堿在羊湯、火鍋湯、水煮魚湯中加標回收率在69%～88%，RSD 在0.2%～5.5%。由此可見，此方法具有較低的定量限、檢出限，在線性范圍內各目標化合物的相關性良好，同時具有較好準確度和精密度。

表7 5 種生物堿準確度與精密度結果（n=6）

3 結論

本文對比分析了5 種生物堿在羊湯、火鍋湯以及水煮魚湯基質中的基質效應強弱，同時用溶劑外標法、基質外標法、溶劑內標法、基質內標法4 種不同標準工作曲線定量分析加標樣品，指出罌粟堿、那可丁和蒂巴因3 種生物堿在羊湯、火鍋湯以及水煮魚湯基質中的基質效應抑制較弱，溶劑標曲外標法和基質標曲外標法定量結果均能滿足實驗室質量控制規范；而嗎啡和可待因2 種生物堿在羊湯、火鍋湯以及水煮魚湯基質中受到的基質效應抑制為中等強度，考慮高效QuEChERS 前處理是影響嗎啡、可待因提取效率的第一影響因素，而基質效應為次影響因素，經過對比分析只有溶劑標曲內標法的定量結果能滿足實驗室質量控制規范。通過方法學驗證，結果表明，可以不考慮不同基質對5 種生物堿的影響，采用溶劑標曲外標法定量分析罌粟堿、那可丁、蒂巴因，采用溶劑標曲內標法定量分析嗎啡、可待因，建立一種高效QuEChERS-UPLC-MS/MS 方法，一次性同時檢測羊湯、火鍋湯和水煮魚湯3 種餐飲食品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5 種生物堿的含量。該方法的靈敏度高，準確度、重復性較好，操作簡便、快速，可為市場監管相關餐飲食品中罌粟殼生物堿殘留量提供思路。