椰毒假單胞菌酵米面亞種滅活條件研究

蘇妙貞，丁清龍，曾曉琮，蘇章庭

（廣東省食品檢驗所，廣東廣州 510435）

椰毒假單胞菌酵米面亞種是中國科學家在東北酵米面中分離出的一種致病菌，與唐菖蒲伯克霍爾德菌親緣關系最近，故歸入唐菖蒲伯克霍爾德氏菌[1]。在適宜的溫度下，椰毒假單胞菌酵米面亞種污染食品后產生大量米酵菌酸，米酵菌酸是該菌引起食物中毒的主要原因。2018 年，廣東省東莞市出現第一例因食用河粉米酵菌酸中毒，最終致死的事件。2020 年，廣東省揭陽市惠來縣再次發生河粉米酵菌酸中毒事件；黑龍江省發生了食用酸湯子米酵菌酸中毒的慘劇[2]。近年來，濕米粉被椰毒假單胞菌酵米面亞種污染多次引起米酵菌酸中毒事件，研究濕米粉中該菌的滅活條件變得迫切。

在濕米粉生產過程中，企業常用的殺菌手段有加熱殺菌、紫外輻照殺菌，其中加熱殺菌用于濕粉蒸煮工藝，紫外輻照殺菌用于車間環境日常清潔消毒。蛋白質是微生物的重要組成成分，蛋白質變性或凝固可使微生物失去活性而死亡，加熱能使蛋白質變性。在60 ℃下，蛋白質開始變性，細菌一般在65 ～80 ℃就能被殺死，但一些芽孢菌在環境惡劣時能產生芽孢，100 ℃以上的高溫才能使芽孢失活[3]。椰毒假單胞菌酵米面亞種不產生芽孢，從結構上看，該菌不耐高溫。因食品基質不宜使用化學滅菌方法，紫外線輻照殺菌是食品企業常用的消毒手段，特定波長范圍內的紫外線照射可破壞微生物細胞中的核酸，導致微生物的死亡，以達到消毒殺菌的目的[4]。紫外劑量是影響殺菌效果的直接因素，與照射所用的紫外線燈強度成正比，與物體被照射的時間成正比[5]。本文從加熱滅菌和紫外滅菌兩方面，研究殺滅椰毒假單胞菌酵米面亞種的物理條件。在液體培養基中培養一段時間后，椰毒假單胞菌酵米面亞種能在液面產生菌膜，菌膜容易覆蓋在設備表面上生長，比菌體更具抗性，因此加熱滅菌實驗分別針對菌體與菌膜進行[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株分離自碎米，經VITEK 2 鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌，經產毒實驗提取到米酵菌酸的產毒株。GVC 增菌液、馬鈴薯葡萄糖水（Potato Dextrose Water，PD 水）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）、平板計數瓊脂（Plate Count Agar，PCA），均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋；SX-700 高壓滅菌鍋；LRH-250 生化培養箱；AC2-4S1 生物安全柜；紫外燈管（229.1 μW·cm-2、154.1 μW·cm-2、80.0 μW·cm-2）。

1.3 實驗方法

1.3.1 加熱滅活實驗

（1）椰毒假單胞菌酵米面亞種菌體加熱滅活實驗。取培養3 d 后的椰毒假單胞菌酵米面亞種PDA 平板上菌苔，用生理鹽水配制濃度為108CFU·mL-1的菌懸液，按比例稀釋為105CFU·mL-1和102CFU·mL-1的菌懸液，3 種菌懸液各配制60 mL，用低、中、高濃度菌液分別代表102CFU·mL-1、105CFU·mL-1、108CFU·mL-1的菌液。準備已滅菌的1.5 mL 離心管，放入1 mL 菌液，封好后置于調好溫度的水浴鍋中處理一定時間。處理完后取出冷卻，將菌液倒入平板中，倒入PDA 瓊脂混勻，于36 ℃培養48 h。相同步驟設立空白對照，空白對照無需于水浴鍋中加熱處理，實驗組做2 份平行樣。處理溫度為60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃，處理時間為10 s、30 s、60 s、90 s、120 s、180 s 和300 s，記錄平板生長情況。

（2）菌膜加熱滅活實驗。椰毒假單胞菌酵米面亞種在生長過程中會產生菌膜，菌膜易在輸送米漿的管道內附著滋生。當管道內滋生菌膜后，米漿流過可能會攜帶椰毒假單胞菌酵米面亞種的菌膜，本實驗研究加熱能否將菌膜中的椰毒假單胞菌酵米面亞種殺死。挑取一環椰毒假單胞菌酵米面亞種接種至10 mL 無菌馬鈴薯葡萄糖水（PD 水）試管中，30 ℃培養6 d 后形成菌膜。用接種針小心挑取菌膜放置于無菌濾膜中央，以經燒灼滅菌后的不銹鋼片為承托，放入鍋中。用沸騰狀態的常壓水蒸氣分別蒸煮處理0.5 min、1.0 min、1.5 min、2.0 min 和3.0 min 后，將濾膜貼于平板計數瓊脂表面于36 ℃培養，取未經加熱處理的菌膜濾膜貼于平板計數瓊脂表面培養作為未處理空白參照。

1.3.2 紫外殺滅椰毒假單胞菌酵米面亞種實驗

紫外線消毒殺菌法是食品企業常用的消毒方式，本實驗探究紫外線強度、照射時間對椰毒假單胞菌酵米面亞種殺滅效果的影響。以108CFU·mL-1的菌液配制107CFU·mL-1、105CFU·mL-1、103CFU·mL-1椰酵假單胞菌酵米面亞種菌液，涂布于PDA 平板后，將PDA 平板分別置于229.1 μW·cm-2（模擬高強度紫外線燈）、154.1 μW·cm-2（模擬中強度紫外線燈）、80.0 μW·cm-2（模擬普通30 W 紫外線燈）紫外線燈管下作用2 min、5 min、10 min、15 min 和30 min，作用結束后放置于36 ℃培養48 h，觀看菌落生長結果，每個實驗做兩個平行。

2 結果與分析

2.1 加熱滅活實驗結果分析

2.1.1 椰毒假單胞菌酵米面亞種菌體加熱滅活結果分析

平板上無菌落生長即為殺滅率達到100%，統計3 種濃度菌液經加熱處理后達到100%殺滅率的溫度與處理時間，結果見圖1。菌液濃度越高，殺滅全部細菌所需的時間越長。隨著處理溫度的升高，殺滅全部細菌所需的時間大幅縮短。《濕米粉生產和經營衛生規范》（DBS44/ 017—2021）要求蒸煮定型時長需保持1 min 以上，企業的蒸煮隧道濕粉從頭到尾蒸煮約1.5 min，使用100 ℃處理1.5 min 的加熱方法能有效殺滅椰毒假單胞菌酵米面亞種菌體。

圖1 殺滅率為100%時，不同濃度菌液所需處理溫度與時間

2.1.2 菌膜加熱滅活實驗結果分析

由圖2 可知，未經熱處理的菌膜表面濕潤，擴散生長；經熱處理過的菌膜表面干燥，無繼續生長跡象，表明菌膜已失去活性，這說明菌膜的耐熱性不強，經常壓下水蒸氣處理0.5 min 即可殺滅。

圖2 菌膜加熱滅活實驗結果

2.2 紫外殺滅椰毒假單胞菌酵米面亞種實驗結果

由 圖3 可 知，在229.1 μW·cm-2紫 外 線 作 用下，15 min 可殺滅103CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種，30 min 可殺滅105CFU·mL-1、107CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種。

圖3 高強度紫外線下殺菌效果

由圖4 可知，在154.3 μW·cm-2紫外線作用下，15 min 可殺滅103CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種，30 min 可部分殺滅105CFU·mL-1及107CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種。

圖4 中強度紫外線下殺菌效果

由 圖5 可 知，在80.3 μW·cm-2紫 外 線 作 用下，作用30 min 未能殺滅107CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種，作用30 min 可殺滅部分105CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種，作用15 min 可殺滅103CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種，但作用30 min 發現103CFU·mL-1濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種存在部分生長，可能因擺放不當導致殺滅效果有偏差。

圖5 低強度紫外線下殺菌效果

3 結論與討論

濕米粉的生產過程為大米浸泡、自來水清洗、磨漿、調節波美度、加熱熟化、定型、鼓風冷卻、切刀切割和稱重包裝[7]，加熱熟化為生產過程中的關鍵步驟。研究表明，椰毒假單胞菌酵米面亞種主要來源于生產原料中的米，在加工過程中能污染到米漿和輸送管路[8]。熟化步驟為產品從生到熟的加工步驟，該過程通過加熱殺死椰毒假單胞菌酵米面亞種。本次實驗表明，根據廣東省衛生健康委員會發布的《食品安全地方標準 濕米粉生產和經營衛生規范》（DBS 44/017—2021）中8.2“應制定蒸煮定型間（區）崗位操作規程，對蒸煮定型設備的壓力或溫度等關鍵條件進行監控，確保加熱溫度≥100 ℃、加熱時間保持1 min 以上，或采用其他等效殺菌效果的熱加工工藝，并做好記錄”的要求[9]，生產企業可以用加熱方式殺死米漿中存在的菌或菌膜。濕米粉生產企業一般使用紫外燈進行表面消毒，實驗表明紫外線能殺死一定濃度的菌，但受照射距離、照射物品厚度的影響，消毒效率有一定損失。因此，企業應以加熱殺菌為主，紫外照射為輔的手段殺滅濕米粉中的椰毒假單胞菌酵米面亞種。