淺析公共環(huán)境領(lǐng)域微生物檢測方法及應(yīng)用

趙瑩 陳文

【摘要】公共場所中致病微生物可通過空氣流通和公共用品進(jìn)行傳播，對人體產(chǎn)生危害，為加強(qiáng)公共場所衛(wèi)生消毒意識，保證公共用品安全，本文就公共環(huán)境領(lǐng)域空氣及公共用品的微生物檢測方法及應(yīng)用做出綜述。

【關(guān)鍵詞】公共環(huán)境；微生物采樣；微生物檢測

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.01.027

Analysis on Microbial Detection Methods and Application in Public Environmental Field

ZHAO Ying，CHEN Wen

（Liaoning Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Shenyang 110000，China）

Abstract：Pathogenic microorganisms in public places can be spread through air circulation and public goods，which may cause harm to human body. In order to strengthen the awareness of sanitation and disinfection in public places and ensure the safety of public goods，this paper reviews the microbial detection methods and applications of air and public goods in the public environment field.

Key words：public environment；microbial sampling；microbiological detection

細(xì)菌、真菌、病毒等微生物附著在空氣氣溶膠表面便形成生物氣溶膠[1]。公共場所內(nèi)空氣通過集中空調(diào)循環(huán)，可將致病微生物從一個(gè)房間擴(kuò)散至其他房間，從而導(dǎo)致人體發(fā)生過敏反應(yīng)和其他疾病的傳播。同樣地，公共場所內(nèi)的公共物品也具有傳播致病微生物的風(fēng)險(xiǎn)。如果公共物品使用后未消毒或消毒不徹底，則會導(dǎo)致致病微生物存活，甚至生長繁殖，造成疾病傳播。因此應(yīng)對公共場所定期進(jìn)行微生物檢測，以減少致病微生物傳播風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防傳染病擴(kuò)散。本文就公共場所的空氣及公共用品的微生物檢測方法及應(yīng)用進(jìn)行綜述，為完善公共衛(wèi)生安全提供參考。

1公共環(huán)境內(nèi)微生物采樣方法

1.1空氣

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18204.3—2013《公共場所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法第3部分：空氣微生物》規(guī)定，細(xì)菌總數(shù)、真菌總數(shù)采用撞擊法和自然沉降法采樣，β-溶血性鏈球菌使用撞擊法采樣，嗜肺軍團(tuán)菌采用液體沖擊法采樣[2]。

1）撞擊法需避開通風(fēng)口和通風(fēng)管道等地，在距地面1.2～ 1.5 m、離墻壁1 m以上的位置，門窗關(guān)閉15～30 min后進(jìn)行采樣。50 m2以下的場所在中央設(shè)置一個(gè)采樣點(diǎn)，50～200 m2設(shè)置2個(gè)對稱點(diǎn)，200 m2以上的以對角線四等分點(diǎn)或梅花布點(diǎn)設(shè)置3～5個(gè)采樣點(diǎn)。無菌操作使用撞擊式微生物采樣器按照說明書以28.3 L/min的流量采集5～15 min。

2）自然沉降法與撞擊法的不同之處在于在50 m2以下的場所中以對角線四等分點(diǎn)設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)，在50 m2以上的場所中以梅花布點(diǎn)設(shè)置5個(gè)采樣點(diǎn)。將含有培養(yǎng)基的平板放置于采樣點(diǎn)后打開皿蓋，暴露5 min采樣。

3）液體沖擊法采樣點(diǎn)同上，使用倒入20 mL的GVPC液體培養(yǎng)基和1～2滴礦物油的微生物氣溶膠采樣器與微生物氣溶膠濃縮器連接，按照儀器的說明書操作，采集1～2 m3空氣量的氣溶膠樣品。再將倒入20 mL的酵母提取液和1～2滴礦物油的微生物氣溶膠采樣器與微生物氣溶膠濃縮器連接，在同一采樣點(diǎn)上按照儀器的說明書操作，采集1～2 m3空氣量的氣溶膠樣品。采集后的樣品需要在4 h內(nèi)送檢。

1.2公共用品

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18204.4—2013《公共場所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法第4部分：公共用具微生物》規(guī)定，采樣部位以檢測對象分類，主要分為杯具、棉織品、潔具、鞋類、購物車（筐）、美容美發(fā)美甲和其他物品[3]。采樣時(shí)使用滅菌后的干燥棉拭子在10 mL無菌生理鹽水中浸濕反復(fù)均勻涂抹公共用品。將棉簽手拿部分剪掉后放入生理鹽水內(nèi)，在采樣后4 h內(nèi)送檢。

2公共環(huán)境內(nèi)微生物檢測方法

2.1細(xì)菌總數(shù)

2.1.1空氣

1）采樣后將營養(yǎng)瓊脂平板放置于35～37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后菌落計(jì)數(shù)。2）結(jié)果報(bào)告。撞擊法需按稀釋比和采氣體積將菌落計(jì)數(shù)單位換算成CFU/m3，以全部采樣點(diǎn)中測定最大值作為測定結(jié)果。自然沉降法需要計(jì)數(shù)每一塊平板上的菌落數(shù)并計(jì)算全部采樣點(diǎn)的平均菌落數(shù)，單位為CFU/皿。

2.1.2公共用品

1）將含有采樣后棉拭子的生理鹽水充分搖勻作為1∶10的樣品稀釋液，再吸取1 mL的1∶10樣品稀釋液緩慢注入9 mL無菌生理鹽水內(nèi)反復(fù)吹吸作為1∶100的樣品稀釋液，以此方法進(jìn)行10倍遞增稀釋。估計(jì)樣品受污染的情況，選擇1～2個(gè)合適稀釋度的1 mL樣品稀釋液分別吸取到2個(gè)無菌平皿里。分別吸取1 mL生理鹽水到2個(gè)無菌平皿里作為空白對照。待融化的計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基冷卻到45～50℃時(shí)，向每個(gè)平皿中倒入15～20 mL培養(yǎng)基并混合均勻。瓊脂凝固后在（36±1）℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)（48±2）h。2）菌落計(jì)數(shù)。選擇菌落數(shù)在30～300 CFU之間且無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)。3）結(jié)果報(bào)告。菌落計(jì)數(shù)后按結(jié)果公式進(jìn)行計(jì)算得出結(jié)果報(bào)告。

2.2真菌總數(shù)

2.2.1空氣

1）采樣后將沙氏瓊脂平板放置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察并于第5天計(jì)數(shù)。若真菌數(shù)量過多可在第3天計(jì)數(shù)。

2）結(jié)果報(bào)告。同2.1.1中2）。

2.2.2公共用品

1）將含有采樣后棉拭子的生理鹽水充分震蕩使孢子散開作為1∶10的樣品稀釋液。分別取1 mL的1∶10樣品稀釋液加入2個(gè)無菌平皿中。再取1 mL的1∶10樣品稀釋液加入9 mL無菌生理鹽水內(nèi)反復(fù)吹吸作為1∶100的樣品稀釋液。以此方法進(jìn)行10倍遞增稀釋。估計(jì)樣品受污染的情況，選擇3個(gè)合適稀釋度。待融化的沙氏瓊脂培養(yǎng)基冷卻至45℃時(shí)倒入滅菌平皿中。瓊脂凝固后將平板倒置于25～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后開始觀察，共培養(yǎng)觀察1周。2）菌落計(jì)數(shù)。選擇菌落數(shù)在5～50 CFU之間的平板計(jì)數(shù)。3）結(jié)果報(bào)告。菌落計(jì)數(shù)后按結(jié)果公式進(jìn)行計(jì)算得出結(jié)果報(bào)告。

2.3β-溶血性鏈球菌

空氣微生物中β-溶血性鏈球菌使用血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方法檢測。將采樣后的血瓊脂平板在35～37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h后觀察菌落形態(tài)，根據(jù)菌落特征判斷是否有β-溶血性鏈球菌生長及計(jì)數(shù)。按稀釋比和采氣體積將菌落計(jì)數(shù)單位換算成CFU/m3，以全部采樣點(diǎn)中測定最大值作為測定結(jié)果。

2.4溶血性鏈球菌

公共用品的溶血性鏈球菌檢測是取1 mL樣品放入9 mL葡萄糖肉浸液肉湯中或直接在血平板上劃線培養(yǎng)，若樣品污染嚴(yán)重，則取1 mL樣品放入9 mL在匹克氏肉湯中（36±1）℃培養(yǎng)24 h后接種于血平板上（36±1）℃培養(yǎng)24 h。挑起有溶血圓形的細(xì)小菌落在新的血平板上分離純化處理，觀察其溶血情況及菌落特征，并進(jìn)行革蘭氏染色。根據(jù)菌落特征及染色結(jié)果判斷是否有溶血性鏈球菌生長。

2.5嗜肺軍團(tuán)菌

空氣微生物檢測此項(xiàng)。各取1 mL采樣后的GVPC液體培養(yǎng)基和酵母提取液，分別加入鹽酸氯化鉀溶液，調(diào)節(jié)pH至2.2，靜置15 min后分別加入1 mol/L氫氧化鉀溶液中和pH至6.9。各取懸液0.2～0.3 mL分別接種于GVPC平板上。將平板置于35～37°C，5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。從第3天開始觀察菌落生長狀態(tài)。挑選2個(gè)符合嗜肺軍團(tuán)菌菌落特征的可疑菌落，接種于BCYE瓊脂平板和L-半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板上35～37°C培養(yǎng)2 d確定陽性菌落。通過生化培養(yǎng)與血清學(xué)實(shí)驗(yàn)確定嗜肺軍團(tuán)菌菌型。2種采樣液中有1種檢出即為陽性，任一采樣點(diǎn)檢出陽性即判定陽性。

2.6大腸菌群

公共用品的大腸菌群檢測采用乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)。將采集的樣品倒入雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中放置于（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h。若不產(chǎn)酸產(chǎn)氣即可報(bào)告大腸菌群陰性。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣則進(jìn)一步進(jìn)行分離培養(yǎng)和證實(shí)實(shí)驗(yàn)。分離培養(yǎng)是取一環(huán)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的培養(yǎng)液接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色。證實(shí)實(shí)驗(yàn)是在平板上挑取1～2個(gè)可疑菌落接種到乳糖發(fā)酵管中（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，觀察是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣。若有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象產(chǎn)生，即為陽性；反之則為陰性。

2.7金黃色葡萄球菌

公共用品中的金黃色葡萄球菌檢測是取1 mL樣品放到9 mL氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯內(nèi)（36±1）℃培養(yǎng)24 h。取1～2環(huán)接種液劃線接種于Baird-Parker平板或血平板上（36±1）℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。挑取符合菌落特征的可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。并通過血漿凝固酶試驗(yàn)判斷是否有金黃色葡萄球菌生長。凡在平板上典型菌落生長，革蘭氏染色及血漿凝固酶陽性現(xiàn)象，即為檢出。

3公共環(huán)境內(nèi)微生物檢測應(yīng)用情況

公共環(huán)境的微生物合格率可以反映該場所消毒效果。微生物指標(biāo)越高則含有的致病微生物的可能性越高[4]。在公共環(huán)境空氣微生物檢測方面，羅定市林燕明等人于2019至2020年監(jiān)測了128間公共場所空調(diào)房的空氣微生物污染狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)真菌的合格率為92.97%、細(xì)菌合格率為96.09%，總體空氣質(zhì)量較為理想[5]。但與歐木生報(bào)道的羅定市157家公共場所在2017至2019年的室內(nèi)空氣真菌總數(shù)合格率93.3%及細(xì)菌總數(shù)合格率96.2%相比，略有下降[6]。陜西省賈茹等人于2018和2019年監(jiān)測陜西省賓館酒店共128家室內(nèi)空氣微生物污染情況，細(xì)菌總數(shù)合格率分別為97.48%和94.64%[7]。劉靜媛等人報(bào)道了遼陽市2016至2019年52家5類重點(diǎn)公共場所的室內(nèi)空氣細(xì)菌總數(shù)合格率為100%，其中賓館內(nèi)空氣真菌合格率逐年為60%、65%、65%和80%，呈上升趨勢[8]。由以上結(jié)果可以看出，公共場所空氣微生物檢測趨向檢測細(xì)菌總數(shù)，真菌總數(shù)測定合格率相對略低，應(yīng)引起重視。

在公共用品微生物檢測方面，六安市翟和亮等人在2018至2019的2年內(nèi)共檢測公共用品4109份，涉及公共場所135家，調(diào)查結(jié)果顯示總樣品合格率為96.11%，其中2018年合格率95.32%，2019年合格率為96.91%；2年內(nèi)總樣品合格率最低的為茶具類94.55%；金黃色葡萄球菌合格率為100%。朱昱等人報(bào)道了2018至2019合肥市部分公共用品微生物檢測結(jié)果，涉及公共場所共104家，樣品微生物合格率93.7%，其中合格率最低的樣品是浴衣79.1%，大腸菌群和金黃色葡萄球菌2年平均合格率均為100%。陳建琳和劉明輝調(diào)查淮安市淮安區(qū)2015至2017年584家公共場所的微生物總合格率78.5%，其中合格率最高的是娛樂場所的茶具為89.4%，最低的是沐浴場所的拖鞋為57.8%；就檢測項(xiàng)目而言，金黃色葡萄球菌合格率高達(dá)100%，霉菌的合格率最低僅為57.8%。以上監(jiān)測數(shù)據(jù)表明公共用具中金黃色葡萄球菌檢出率低，但金黃色葡萄球菌作為最常見的致病菌之一，仍要嚴(yán)加防范，不能掉以輕心。

4結(jié)語

近年我國各地公共場所的衛(wèi)生狀況逐年提高，但公共用品的微生物污染情況仍存在一定問題，要引起當(dāng)?shù)毓芾聿块T的重視。通過定期監(jiān)測公共場所的微生物污染程度，可以加強(qiáng)衛(wèi)生部門對當(dāng)?shù)毓矆鏊l(wèi)生情況的了解，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題并提出整改，督促場所負(fù)責(zé)人加強(qiáng)消殺工作頻率，提高公共場所的空氣及公共用品衛(wèi)生狀況，保障公眾的生命健康安全。

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【作者簡介】

趙瑩，女，1996年出生，助理工程師，研究方向?yàn)槲⑸餀z測。通訊作者：陳文，男，1989年出生，工程師，研究方向?yàn)槭覂?nèi)環(huán)境檢測。聯(lián)系方式：13238881189。

（編輯：李加鵬）