雙酶法制備條斑紫菜酶解液工藝優化及抗氧化、抗疲勞活性研究

張夢雪 葉靜靜 高子鑫 沈祥皓 胡金雨 盤賽昆

摘要：研究雙酶法制備條斑紫菜酶解液工藝優化及其抗氧化、抗疲勞活性。以水解度為指標，經篩選確定由中性蛋白酶和堿性蛋白酶復配，通過單因素試驗和響應面優化試驗得到最優工藝條件：中性蛋白酶與堿性蛋白酶添加量比例為1∶3，酶解pH為 8，加酶量為2.0%，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為2 h。該條件下酶解液水解度為33.81%，對DPPH、ABTS+、OH自由基有一定的清除能力，并能夠提高小鼠的運動耐力，延長力竭游泳時間，降低運動后血乳酸水平，為條斑紫菜后期加工利用提供了理論依據。

關鍵詞：條斑紫菜；雙酶水解；工藝優化；抗氧化；抗疲勞

中圖分類號：TS254.58? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）07-0007-07

Abstract：The process optimization， antioxidant and anti-fatigue activities of the enzymatic hydrolysate of Porphyra yezoensis prepared by double-enzyme method are studied. With the degree of hydrolysis as the index， the combination of neutral protease and alkaline protease is determined through screening.Through single factor test and response surface optimization test， the optimum technological conditions are determined as follows： the ratio of neutral protease to alkaline protease is 1∶3， the enzymolysis pH is 8， the enzyme addition amount is 2.0%， the enzymolysis temperature is 50 ℃ and the enzymolysis time is 2 h. Under these conditions， the degree of hydrolysis of the enzymatic hydrolysate is 33.81%， and it has a certain scavenging capacity on DPPH， ABTS+， OH free radicals， and can improve the exercise endurance of mice， prolong the exhaustion swimming time， and reduce the level of blood lactic acid after exercise. The research has provided a theoretical basis for the later processing and utilization of Porphyra yezoensis.

Key words： Porphyra yezoensis； double-enzyme hydrolysis； process optimization； antioxidation； anti-fatigue

條斑紫菜（Porphyra yezoensis）隸屬于紅藻門，為我國的主要經濟藻類之一，具有較高的食用價值。有研究表明，干條斑紫菜含有蛋白質、多糖、牛磺酸、礦物質和膳食纖維，還含有多肽、多酚類等生物活性物質[1-3]，脂肪含量僅占1%左右。多肽、多糖、牛磺酸等活性物質具有抗氧化、抗疲勞、調節免疫力、降血脂等多種生理功能[4-7]。因此，可以認為條斑紫菜是一種低脂肪的優質海洋食品。利用酶法制備生物活性物質已廣泛用于食品工業中，其反應條件溫和，專一性強，反應進程容易控制，綠色無污染[8]。僅用一種酶對條斑紫菜進行酶解的不足之處是水解度低、活性低，而不同蛋白酶的作用位點有很大差異，采用雙酶協同酶解是提高水解度的可行方法[9]。因此，采用雙酶法能得到水解度較高的條斑紫菜酶解液，提高條斑紫菜的利用價值。

試驗以干條斑紫菜為原料，采用雙酶法制備條斑紫菜酶解液。以水解度為評價指標，對其酶解工藝進行優化，并對其產物的抗氧化和抗疲勞活性進行初步研究，以期為條斑紫菜的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干條斑紫菜：連云港力優食品有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶：河南萬邦化工科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、甲醛、DPPH、ABTS、OH、無水乙醇、過硫酸鉀、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫等：均為分析純，江蘇一青生物科技有限公司；乳酸（LD）測試盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗動物

SPF級雄性健康小鼠：質量（20±2） g，揚州大學比較醫學中心。

1.3 主要儀器與設備

PHSJ-3F實驗室pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；SHA-2數顯冷凍水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市億通電子有限公司；SP-754紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；DDL-5M低速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 紫菜酶解液的制備

參照劉冰等[10]的方法稍加修改，干條斑紫菜經超微粉碎，過80目篩，按料液比1∶30（g/mL）向干條斑紫菜粉中加入蒸餾水，于濕法粉碎機中在頻率35 Hz下粉碎1 h，按質量分數加入5%纖維素酶，25 ℃酶解6 h，制得紫菜勻漿溶液。調節溶液pH，加蛋白酶酶解，沸水滅酶10 min，5 000 r/min離心20 min，取上清液制得紫菜酶解液。

將紫菜酶解液冷凍干燥，于4 ℃冰箱中保存，用于研究抗氧化性和抗疲勞性時配制成不同濃度的酶解液。

1.4.2 蛋白酶篩選試驗

選用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶5種蛋白酶在各自適宜條件下酶解得紫菜初提液，每隔1 h取樣沸水滅酶，取上清液測其水解度，共計5 h。以水解度為篩選指標，篩選出兩種適宜酶解干條斑紫菜的酶。

1.4.3 單因素試驗

以酶解液的水解度為評價指標，考察酶配比、酶解pH、加酶量、酶解溫度及酶解時間5個因素對水解度的影響。

1.4.3.1 酶配比對水解度的影響

在酶解pH 8、酶解溫度50 ℃、加酶量20 000 U/g·pro、酶解時間2 h的條件下，研究加酶量配比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4時對水解度的影響。

1.4.3.2 酶解pH對水解度的影響

在酶配比1∶3，酶解溫度50 ℃、加酶量20 000 U/g·pro、酶解時間2 h的條件下，研究酶解pH為6，7，8，9，10時對水解度的影響。

1.4.3.3 加酶量對水解度的影響

在酶配比1∶3、酶解pH 8、酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h的條件下，研究加酶量為10 000，15 000，20 000，25 000，30 000 U/g·pro時對水解度的影響。

1.4.3.4 酶解溫度對水解度的影響

在酶配比1∶3、酶解pH 8、加酶量20 000 U/g·pro、酶解時間2 h的條件下，研究酶解溫度為40，45，50，55，60 ℃時對水解度的影響。

1.4.3.5 酶解時間對水解度的影響

在酶配比為1∶3，酶解pH 8，加酶量20 000 U/g·pro、酶解溫度50 ℃的條件下，研究酶解時間為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h時對水解度的影響。

1.4.4 響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，從5個單因素中選擇對水解度影響顯著的3個因素，使用Design-Expert 13軟件，以水解度為響應值，設計三因素三水平試驗，具體響應面試驗因素水平見表1。

1.4.5 水解度的測定

參照張修正等[11]的方法測定。水解度測定的計算公式如下：

水解度（%）=XN×100。

式中：X為酶解上清液中游離氨基酸態氮含量，g；N為樣品中總氮含量，g。

1.4.6 體外抗氧化活性研究

以DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基清除率為指標，V C作為陽性對照，研究條斑紫菜酶解液的抗氧化活性。

1.4.6.1 DPPH自由基清除率的測定

參照劉靜等[12]的方法稍加修改，取酶解液2 mL，加0.1 mmol/mL DPPH溶液2 mL，室溫避光反應30 min，無水乙醇作為參比溶液，在517 nm處測定吸光值（A 1），同時測定2 mL酶解液和2 mL無水乙醇混勻后的吸光值（A 2），2 mL無水乙醇和2 mL DPPH溶液混勻后的吸光值（A 3），計算DPPH自由基清除率。

DPPH·清除率（%）=（1－A 1－A 2A 3）×100。

1.4.6.2 ABTS陽離子自由基清除率的測定

參照趙世光等[13]的方法，配制在734 nm處吸光值達到0.7±0.02的ABTS陽離子溶液，取1 mL酶解液與4 mL ABTS+·混合，精確避光反應6 min，在734 nm處測定吸光值（A 1），同時測定1 mL酶解液與4 mL無水乙醇混合后的吸光值（A 2），1 mL無水乙醇和4 mL ABTS+·混合后的吸光值（A 3），計算ABTS+·清除率。

ABTS+·清除率（%）=（1－A 1－A 2A 3）×100。

1.4.6.3 羥自由基清除率的測定

參照許繼業等[14]的方法，向試管中依次加入9 mmol/L水楊酸-乙醇、9 mmol/L FeSO 4、酶解液、8.8 mmol/L H 2O 2各1 mL，37 ℃水浴15 min，在510 nm處測吸光值（A 1），按上述操作用蒸餾水替換酶解液測吸光值（A 2），蒸餾水替換H 2O 2測吸光值（A 3），計算羥自由基清除率。

·OH清除率（%）=（1－A 1－A 2A 3）×100。

1.4.7 體內抗疲勞活性研究

參照馬曉寧等[15]的方法并加以修改。將小鼠隨機分成4組，分別為空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組20只小鼠，低劑量組每天經口灌胃0.1 mg/g紫菜酶解液、中劑量組0.2 mg/g紫菜酶解液、高劑量組0.3 mg/g紫菜酶解液。為方便灌喂，將凍干后的紫菜酶解液配成各劑量組相對應濃度的溶液。空白對照組替換為等量的生理鹽水，各試驗組動物經口灌胃連續給予30 d。

1.4.7.1 力竭游泳試驗

參照瞿東楊等[16]的方法，每組取10只小鼠，在第30天灌喂樣品30 min后，在小鼠尾部負其質量5%的鉛塊，置于水深35 cm、水溫25 ℃的游泳箱中游泳。游泳期間如有弓腰停止、懸浮休息者，用玻璃棒刺激游動以防偷懶，當小鼠沉入水下10 s不能浮出水面則視為力竭，用秒表記錄從游泳開始至力竭的時間作為小鼠力竭游泳時間。

1.4.7.2 血乳酸含量的測定

參照卓長清等[17]的方法并加以修改，取剩余小鼠，灌喂樣品30 min后，于游泳箱中無負重游泳15 min，斷尾取血，血漿靜置1 h后，4 000 r/min離心30 min，取血清按照乳酸測試盒操作方法測定游泳前、游泳后0 min和游泳后20 min時乳酸含量。

1.4.8 數據處理

采用SPSS 23軟件進行單因素試驗方差分析，當P<0.05時表示具有顯著性差異；采用Origin 2018軟件作單因素試驗結果圖；采用Design-Expert 13軟件進行響應面試驗結果分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選試驗結果

由圖1可知，選取的5種蛋白酶對條斑紫菜的水解度都有效果，由于不同蛋白酶的作用位點有所不同，不同蛋白酶作用后的水解度有所區別。結果表明，堿性蛋白酶作用的水解度最高，其次是中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶，木瓜蛋白酶最低，說明堿性蛋白酶和中性蛋白酶的水解效果較好，因此選用這兩種酶對條斑紫菜進行酶解。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶配比對水解度的影響

由圖2可知，隨著中性蛋白酶與堿性蛋白酶配比的減小，水解度呈現先上升后下降的趨勢，在1∶3時最高，水解度為36.52%。說明兩種酶作用的酶切位點有所不同，有互補的作用，能夠提高水解度[18]。因此，選擇中性蛋白酶與堿性蛋白酶的配比為1∶3作為單因素最適酶配比。

2.2.2 酶解pH對水解度的影響

由圖3可知，在pH為6～10時，隨著pH的增大，水解度呈現先上升后下降的趨勢，且具有顯著性差異（P<0.05）。條斑紫菜的水解度在復配后的復合酶pH為7～9之間較高，說明復配后的復合酶在pH 7～9范圍內活力較好，且當pH為8時，水解度達到最大值31.47%。因此，選擇pH為7，8，9 3個水平進行響應面優化。

2.2.3 加酶量對水解度的影響

由圖4可知，條斑紫菜的水解度在加酶量從10 000 U/g·pro增加到20 000 U/g·pro上升顯著（P<0.05）；在加酶量為20 000 U/g·pro時，水解度達到最大值32.35%；在加酶量大于20 000 U/g·pro后，水解度下降并趨于平緩。酶的本質是蛋白質，加酶量超過其最適加酶量時，所加酶不僅作用于底物，還作用于蛋白酶，從而影響酶對底物的水解，導致水解度下降[9]。因此，復合酶添加量的較適范圍在15 000～25 000 U/g·pro之間。

2.2.4 酶解溫度對水解度的影響

由圖5可知，酶解溫度在40～60 ℃范圍內，水解度隨著溫度的增加呈現先上升后下降的趨勢，且有顯著性差異（P<0.05）。在50 ℃時達到較高值32.45%。溫度是影響酶活性變化的主要因素之一，在最適溫度條件下酶能表現出最大的活性，不在最適溫度范圍時，酶的活性受到抑制，從而降低了對底物的水解能力，水解度下降[19]。根據試驗結果，選擇酶解溫度45，50，55 ℃作為響應面試驗的因素水平。

2.2.5 酶解時間對水解度的影響

由圖6可知，隨著酶解時間的延長，條斑紫菜的水解度呈現先上升后基本不變的趨勢。在2 h時水解度達到最大值33.85%，隨后保持平緩，無顯著性差異（P＞0.05）。這是由于隨著酶解時間的延長，條斑紫菜逐漸被水解，水解度增加；2 h后反應趨于飽和狀態，水解度趨于穩定水平。因此，選擇酶解時間2 h作為最佳工藝條件。

2.3 響應面試驗結果

雙酶法制備紫菜液工藝各因素間存在交互作用，根據單因素研究結果，為確定最佳工藝，選擇酶解pH（A）、加酶量（B）和酶解溫度（C）3個因素，設計響應面試驗，結果見表2。

通過Design-Expert 13軟件對試驗結果進行二次多項式回歸擬合，得到水解度（Y）與各因素的二次回歸方程模型：Y=33.82－0.090 0A+0.140 0B－0.547 5C+0.087 5AB+0.837 5AC－0.077 5BC－2.08A2－3.72B2－2.88C2。

由表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，極顯著，失擬項的P=0.987 4＞0.05，不顯著，表明此模型的擬合度較好，誤差小。模型的相關系數R2=0.999 5，說明該模型具有可信度，可用該方程來描述各變量與響應值之間的關系，可以用于制備條斑紫菜液工藝優化的預測。在回歸模型中，一次項B、C，交互項AC，二次項A2、B2、C2都表現出極顯著水平；一次項A表現出顯著水平。根據各變量P值的大小，可以判斷出各因素對條斑紫菜水解度影響的大小為酶解溫度＞加酶量＞酶解pH。

2.4 因素間的交互作用對條斑紫菜水解度影響的響應面和等高線分析

由表3和圖7可知，加酶量和酶解溫度對水解度的影響極顯著（P＜0.01），酶解pH與酶解溫度的交互作用極顯著（P＜0.01），酶解pH與加酶量、加酶量與酶解溫度的交互作用不顯著。以水解度為響應值，采用響應面分析軟件優化得到雙酶法制備條斑紫菜酶解液的工藝條件為酶解pH 7.95、加酶量2.01%、酶解溫度49.49 ℃，在此條件下水解度的預測值為33.85%。

2.5 驗證試驗

結合實際操作情況，將優化后的工藝調整為中性蛋白酶與堿性蛋白酶的配比1∶3、酶解pH 8、加酶量2.0%、酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h。進行3次驗證試驗，其水解度平均值為33.81%，用SPSS軟件進行單樣本T檢驗，顯著性為0.128＞0.05，說明驗證值與預測值差異不顯著，此模型可信。

2.6 抗氧化活性研究結果

2.6.1 DPPH·清除率

由圖8可知，在底物濃度為2～20 mg/mL范圍內，隨著條斑紫菜酶解液濃度的增加，DPPH自由基清除率呈上升趨勢，當濃度增加到15 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到97.82%，接近于V C對DPPH自由基的清除效果。

2.6.2 ABTS+·清除率

由圖9可知，在底物濃度為2～20 mg/mL范圍內，隨著底物濃度的增加，條斑紫菜酶解液對ABTS+·的清除率呈上升趨勢。當濃度達到10 mg/mL時，清除率為99.80%，并不再增加，處于穩定狀態，與V C的作用效果相當。

2.6.3 ·OH清除率

由圖10可知，在底物濃度為2～20 mg/mL范圍內，隨著底物濃度的增加，條斑紫菜酶解液對·OH的清除率呈上升趨勢，濃度為20 mg/mL時，清除率為70.29%。整體來看，同濃度下條斑紫菜酶解液對·OH的清除效果不及Vc。

2.7 抗疲勞活性研究結果

2.7.1 條斑紫菜酶解液對小鼠力竭游泳時間的影響

由表4可知，低、中、高劑量組小鼠力竭游泳時間都顯著高于空白對照組，能有效延長游泳時間，而運動耐力能夠宏觀反映機體的抗疲勞能力，力竭游泳時間是衡量機體抗疲勞能力最直接的指標[20]。表明優化后的雙酶法制備紫菜酶解液工藝條件下得到的紫菜酶解液對小鼠耐力的提高有效果。

2.7.2 條斑紫菜酶解液對小鼠血乳酸水平的影響

一般情況下，機體劇烈運動時會產生大量乳酸，導致肌肉酸堿值下降，代謝失調，會引起疲勞。乳酸在肌肉中堆積越多，疲勞程度越嚴重[16]。由表5可知，運動后的小鼠體內乳酸含量迅速上升，在體內堆積，休息20 min后，機體內乳酸含量逐漸下降。通過顯著性分析可知，與空白對照組相比，低、中、高劑量組小鼠運動后血乳酸水平都顯著降低（P<0.05），表明低、中、高劑量組紫菜酶解液都可以降低小鼠運動后血乳酸水平。

3 結論

本文對雙酶法制備條斑紫菜酶解液工藝進行了優化，并對其產物進行了抗氧化和抗疲勞研究。在實驗室條件下，雙酶法制備條斑紫菜液工藝優化后條件為中性蛋白酶與堿性蛋白酶比例1∶3、酶解pH 8、加酶量2.8%、酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h。該條件下水解度為33.81%，相比單酶法有顯著提高，提高了條斑紫菜的利用率。體外抗氧化試驗和體內抗疲勞試驗研究結果表明，條斑紫菜酶解液具有抗氧化和抗疲勞作用，能提高對自由基的清除能力和運動耐力，為條斑紫菜的應用研究提供了參考。

參考文獻：

[1]陳勝軍，于嬌，胡曉，等.汕頭地區不同采收期壇紫菜營養成分分析與評價[J].核農學報，2020，34（3）：539-546.

[2]楊少玲，戚勃，楊賢慶，等.中國不同海域養殖壇紫菜營養成分差異分析[J].南方水產科學，2019，15（6）：75-80.

[3]仲明，張銳.條斑紫菜不同采收期主要營養成分變化情況[J].中國飼料，2003（23）：30-31.

[4]汲晨洋，胡曉，吉宏武，等.條斑紫菜多糖對白鰱魚魚糜凝膠特性及抗氧化活性的影響[J].食品與發酵工業，2022，48（19）：144-152.

[5]GONG G P， ZHAO J X， WANG V J， et al. Structural characterization and antioxidant activities of the degradation products from Porphyra haitanensis polysaccharides[J].Process Biochemistry，2018，74：185-193.

[6]CAO J， WANG J， WANG S， et al. Porphyra species： a mini-review of its pharmacological and nutritional properties[J].Journal of Medicinal Food，2016，19（2）：111-119.

[7]曹蓉，邱磊，侯德興，等.?；撬岬墓δ芗捌湓诩仪萆a中的應用[J].中國飼料，2015（1）：29-32.

[8]孫宜君，常蓉，張嬌，等.雙酶法制備螺旋藻多肽的工藝研究[J].天然產物研究與開發，2012，24（10）：1468-1473.

[9]宋明洋，劉曉蘭.雙酶法制備豌豆肽及其抗氧化活性[J].食品工業，2020，41（4）：108-112.

[10]劉冰，周振，李若敏，等.雙酶法制備條滸苔鮮味肽工藝研究[J].中國調味品，2021，46（4）：102-110.

[11]張修正，梁振魯，裴繼偉，等.雙步酶法制備魷魚加工副產物鮮味酶解液的工藝研究[J/OL].食品與發酵工業：1-9[2023-04-03].https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033502.

[12]劉靜，李湘利，苗仙仙，等.蛋白酶水解雞樅菌制備酶解液工藝優化及抗氧化活性[J].中國調味品，2020，45（3）：77-82.

[13]趙世光，謝東寶，儲欣穎，等.混菌發酵制備茶籽多肽及其抗氧化作用[J].食品與發酵工業，2022，48（6）：147-153.

[14]許繼業，郁萬文，曹福亮，等.不同雄株銀杏葉提取液抗氧化能力及主要功能成分含量差異[J].食品與發酵工業，2022，48（5）：142-149.

[15]馬曉寧，秦令祥，丁昱嬋，等.響應面優化超聲波輔助提取杏鮑菇多糖的工藝及其抗疲勞活性測定研究[J].中國食品添加劑，2023（3）：273-279.

[16]瞿東楊，史潤東東，姜欣，等.?；撬岷涂Х纫蛟诳蛊陲嬃现械淖饔肹J].飲料工業，2018，21（4）：16-19.

[17]卓長清，趙欣，欒朝霞.枸杞刺五加運動飲料研制及抗疲勞作用研究[J].中國食品添加劑，2019，30（12）：131-136.

[18]李園，劉艷，段振華.雙酶法制備牡蠣抗氧化酶解液的工藝優化[J].食品研究與開發，2016，37（15）：118-121.

[19]景言，劉曉蘭，王今雨，等.玉米蛋白水解物的酶法制備及其對結腸炎的緩解作用[J].食品工業科技，2023，44（8）：270-278.

[20]WANG J， LI S S， FAN Y Y， et al.Anti-fatigue activity of the water-soluble polysaccharides isolated from Panax ginseng C.A.Meyer[J].Journal of Ethnopharmacology，2010，130（2）：421-423.