雷帕霉素調控TRAP1抑制三陰型乳腺癌細胞增殖

黃思源?石雅倩?李鑫?盧敏?郭文禮?劉勇成?歐葉濤

【摘 要】目的 分析雷帕霉素通過調控腫瘤壞死因子相關蛋白1（TRAP1）影響三陰型乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的藥理過程，探討雷帕霉素抗乳腺癌的作用機制。方法 將MDA-MB-231隨機分為對照組和不同劑量的雷帕霉素組，隨后分別在24 h和48 h采用四氮唑藍比色實驗檢測雷帕霉素對細胞增殖的影響。同時以半抑制濃度（IC50）為研究條件，采用流式細胞術檢測雷帕霉素對MDA-MB-231細胞周期的影響；采用蛋白免疫印跡法檢測雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR、TRAP1的蛋白表達；采用定量PCR檢測mTOR、TRAP1的mRNA；采用ATP試劑盒檢測ATP含量；采用乳酸試劑盒檢測乳酸的含量。結果雷帕霉素能抑制MDA-MB-231的增殖，在24 h時，細胞增殖率開始下降，48 h時，細胞增殖率下降更明顯，并在10 μmol/L、48 h的條件下達到IC50，且呈劑量及時間依賴性（P < 0.01）。雷帕霉素可以造成細胞周期G1期阻滯（P < 0.01）。與對照組相比，加藥48 h雷帕霉素組TRAP1的mRNA表達下降（P < 0.05），p-mTOR和TRAP1蛋白表達也下降（P < 0.001），而mTOR的mRNA和總mTOR蛋白變化比較差異均無統計學意義（P均> 0.05），ATP含量上升（P< 0.001），乳酸含量下降（P< 0.001）。結論 雷帕霉素可調控三陰型乳腺癌細胞MDA-MB-231的代謝進程而抑制細胞增殖，該過程與TRAP1的下降有關。

【關鍵詞】雷帕霉素；三陰型乳腺癌；腫瘤壞死因子相關蛋白1

Rapamycin affects the proliferation of triple-negative breast cancer cells by regulating TRAP1 Huang Siyuan△， Shi Yaqian， Li Xin， Lu Min， Guo Wenli， Liu? Yongcheng， Ou Yetao. △Guilin Medical University， Guilin 541004， China

Corresponding author， Ou Yetao， E-mail： ouyetao1972@163.com

【Abstract】Objective To investigate the pharmacological process of the effect of rapamycin upon the proliferation of triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells by regulating tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 （TRAP1）， and to unravel the anti-breast cancer mechanism of rapamycin. Methods MDA-MB-231 cells were randomly divided into the control group and different-dose rapamycin groups， and then the effect of rapamycin on cell proliferation was detected by MTT assay at 24 h and 48 h，?respectively. Meantime， the half-maximal inhibitory concentration （IC50） of rapamycin was considered as the research condition. The effect of rapamycin on MDA-MB-231 cell cycle was detected by flow cytometry. The expression levels of mammalian target of rapamycin （mTOR）， p-mTOR and TRAP1 proteins were detected by Western blot. The expression levels of mTOR and TRAP1 mRNA were measured by qPCR. ATP content was detected by ATP kit. The amount of lactic acid was determined by lactate assay kit. Results Rapamycin inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells in a dose- and time-dependent manner （P < 0.01）. The proliferation of MDA-MB-231 cells was decreased at 24 h and significantly decreased at 48 h after rapamycin treatment. IC50 was obtained at?10 μmol/L after 48 h. Rapamycin induced cell cycle arrest at G1 phase （P < 0.01）. Compared with the control group， the expression level of TRAP1 mRNA was significantly down-regulated （P < 0.05）， and the expression levels of p-mTOR and TRAP1 proteins were significantly down-regulated （both P < 0.001）， whereas the expression levels of mTOR mRNA and total mTOR protein were not significantly changed （both P > 0.05）， the content of ATP was significantly increased （P < 0.001）， and the content of lactic acid was significantly decreased （P < 0.001） in the 48-h rapamycin group. Conclusion Rapamycin can inhibit the proliferation of MDA-MB-231 cells by regulating the metabolic process， which is related to the decrease of TRAP1.

【Key words】 Rapamycin； Triple negative-breast cancer； Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在我國乳腺癌的發病率增長迅速，在女性原發腫瘤中所占比例高達15%，且呈明顯年輕化趨勢［1］。三陰型乳腺癌（TNBC）作為乳腺癌的特殊亞型，具有發病年齡偏小、分化程度低、侵襲性高、復發率高等特點［2］。雷帕霉素（Rapa）已經被研究證實是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的別構抑制劑，可以通過抑制mTOR的活性，對腫瘤、代謝類疾病以及神經退行性疾病產生影響［3-5］。腫瘤壞死因子相關蛋白1（TRAP1）是熱休克蛋白90 （HSP90）伴侶家族的成員，主要存在于線粒體中。已有文獻報道，mTOR對于線粒體的活性起到了重要調節作用，而TRAP1作為線粒體呼吸的負調控因子，能夠影響腫瘤細胞的呼吸方式［6-7］。TRAP1被廣泛認為是抗癌分子靶點，雷帕霉素作為mTOR的別構抑制劑可能通過TRAP1發揮藥理作用，目前尚沒有研究提及兩者之間的關系。本研究旨在探討雷帕霉素調控TRAP1影響乳腺癌細胞MDA-MB-231代謝功能的分子機制，從代謝角度探討雷帕霉素影響乳腺癌細胞增殖的作用，豐富雷帕霉素抗腫瘤的作用機制。

材料與方法

一、材 料

胎牛血清，蘇州依科賽生物科技股份有限公司；DMEM，美國Gibco公司；雷帕霉素，MCE公司；mTOR、p-mTOR抗體，CST公司；TRAP1抗體，美國Affinity公司；ATP檢測試劑盒，碧云天生物技術有限公司；乳酸測試盒，南京建成生物工程研究所。

二、細胞培養和分組

人三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231（HTB-26）購自美國ATCC細胞庫。細胞培養基由10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和DMEM構成。將細胞接種在孔板中，24 h細胞貼壁后，將雷帕霉素加入細胞。設置100 nmol/L、500 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L 的濃度梯度檢測雷帕霉素對乳腺癌細胞增殖的影響。同時測定雷帕霉素的半抑制濃度（IC50），并以IC50為雷帕霉素組研究條件，正常細胞作為對照組，進一步研究雷帕霉素對MDA-MB-231細胞周期和能量代謝的影響。

三、方 法

1.四氮唑藍（MTT）比色實驗

取對數生長期的MDA-MB-231接種于96孔板中，種板后24 h使用不同劑量的雷帕霉素處理細胞，加入MTT，檢測各組在490 nm處的吸光度，計算藥物對細胞的抑制率。藥物對細胞的抑制率計算=1-（實驗-空白）/（陰性-空白）×100%。

2. 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達

取對數生長期的MDA-MB-231接種于滅菌培養皿中，24 h加藥，48 h提取總蛋白。用8%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白；300 mA、3 h轉膜至NC膜上，用5%脫脂牛奶封閉，加入一抗于4 ℃過夜；次日加入二抗孵育，洗膜成像。

3. 定量PCR（q-PCR）檢測基因表達

取對數生長期的MDA-MB-231接種于滅菌培養皿中，24 h后加藥，加藥后48 h提取RNA，逆轉錄后上機檢測，約2 h后收取樣本，分析結果。

4. 細胞周期檢測

取對數生長期的MDA-MB-231接種于滅菌培養皿中，24 h后加藥，48 h消化離心后用70%乙醇溶液固定。隔日離心棄上清，用PBS清洗后將PI染色液加入細胞中，上機檢測。

5. ATP檢測試劑盒檢測ATP含量

取對數生長期的MDA-MB-231接種于滅菌培養皿中，24 h后加藥，加入ATP裂解液，多功能酶標儀檢測化學發光值。運用BCA檢測法得出蛋白濃度，可計算出每毫克蛋白所擁有的ATP含量，即ATP濃度（nmol/mg）=測得ATP濃度/蛋白濃度。

6. 乳酸檢測試劑盒檢測乳酸含量

取對數生長期的MDA-MB-231接種于滅菌培養皿中，24 h后加藥，48 h后取上清，使用多功能酶標儀測得波長為530 nm時的吸光度，計算樣本中乳酸的含量。上清中乳酸的含量（mmoL/L）=（樣本-空白）/（標準-空白）×3×4。

四、統計學處理

采用SPSS 25.0統計分析軟件，用進行統計描述，不同劑量給藥組的生長抑制率采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。組間比較采用獨立樣本t檢驗，P < 0.05時差異有統計學意義。

結果

一、雷帕霉素對MDA-MB-231增殖的影響

MTT比色實驗結果顯示，經過不同劑量的雷帕霉素處理后，24 h、48 h的細胞增殖活性均有所下降 （P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001），雷帕霉素對乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖抑制作用呈時間依賴和劑量依賴趨勢，見圖1。雷帕霉素處理細胞48 h的IC50約為10 μmoL/L，因此本研究選用10 μmoL/L、48 h為處理條件，進行下一步的研究。

二、雷帕霉素對MDA-MB-231中mTOR的抑制作用

使用雷帕霉素10 μmoL/L處理細胞，48 h后提取RNA以及蛋白并進行檢測。結果顯示，雷帕霉素組mTOR的mRNA變化差異無統計學意義（P > 0.05），mTOR磷酸化水平降低（P < 0.001），但總蛋白的變化差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖2。

三、雷帕霉素對MDA-MB-231中TRAP1表達的影響

使用雷帕霉素10 μmoL/L處理細胞，48 h后提取RNA以及蛋白進行檢測。結果顯示，與對照組相比，雷帕霉素組TRAP1的基因以及蛋白水平均下降（P < 0.05， P < 0.001）。見圖3。

四、雷帕霉素對MDA-MB-231細胞周期的影響

使用雷帕霉素10 μmoL/L處理細胞48 h，進行PI染色后用流式細胞儀檢測，結果顯示，對照組及雷帕霉素組G0/G1期的細胞百分率分別為 （41.79±2.07）%和（47.3±1.3）%，S期的細胞百分率分別為 （44.73±1.29）%和（42.42±2.3）%，G2/M期的細胞百分率分別為（13.48±1.78）%和（10.08±0.6）%。與對照組相比，雷帕霉素組細胞周期處于G0/G1期的細胞比例升高，且處于S期細胞和G2/M期的細胞比例減少（P < 0.05， P < 0.001），提示雷帕霉素可以阻止MDA-MB-231由G1期進入S期，造成G1期阻滯。見圖4。

五、雷帕霉素對MDA-MB-231的ATP和乳酸的影響

使用雷帕霉素10 μmoL/L處理細胞，48 h后取上清測乳酸含量，于細胞中提取ATP檢測其含量。結果顯示，雷帕霉素組的ATP含量上升，乳酸的釋放量下降（P均 < 0.001）。見圖5。

討論

本研究顯示，使用雷帕霉素處理MDA-MB-231 48 h后其p-mTOR下降，提示雷帕霉素抑制了磷酸化mTOR的活化。雷帕霉素作為一種mTOR抑制劑，可以通過與細胞內受體FK506結合蛋白12（FKBP12）結合抑制mTOR的活性，從而發揮抗腫瘤作用［8］。在本研究中，雷帕霉素抑制乳腺癌細胞的增殖呈劑量和時間依賴性，在48 h時、10 μmoL/L濃度條件下細胞增殖率下降，細胞抑制率接近IC50，并且雷帕霉素造成了G1期阻滯，這與Ozates等［9］的結果一致。這提示雷帕霉素可以通過抑制腫瘤細胞的增殖分化來發揮抗腫瘤作用。

腫瘤細胞生存和增殖離不開能量，糖酵解是腫瘤細胞能量代謝的主要方式［10］。給予雷帕霉素之后的MDA-MB-231生成的ATP上升、乳酸下降，因此推斷雷帕霉素改變了MDA-MB-231的呼吸方式，使其更多地采用氧化磷酸化的呼吸方式進行供能。

TRAP1是HSP90的線粒體同源物，現已被證實在腫瘤細胞的線粒體內膜上廣泛表達［11-12］。Zhang等［13］證實TRAP1的過度表達顯著增加了它們對葡萄糖氧化酶的氧化應激的抵抗力，促進了Warburg效應，而敲除TRAP1能夠下調線粒體有氧呼吸，使細胞對致命刺激敏感，并抑制腫瘤發生；Agorreta等［14］下調TRAP1發現其降低了細胞增殖和存活能力，誘導細胞凋亡，并損害了線粒體功能。本研究提示雷帕霉素能抑制TRAP1的表達，減緩線粒體功能的失調水平，腫瘤細胞的糖酵解水平被削弱。而ATP上升，乳酸下降，則抑制了MDA-MB-231的Warburg效應，促使乳腺癌細胞增殖水平下降［15-17］。

綜上所述，雷帕霉素可以通過抑制磷酸化mTOR的活化來降低TRAP1的表達，進而影響MDA-MB-231的ATP生成量和乳酸釋放量，從而抑制乳腺癌細胞的有氧糖酵解，降低細胞的增殖活性，這為雷帕霉素治療乳腺癌提供了新的理論依據。

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（收稿日期：2022-11-04）

（本文編輯：洪悅民）