氣相色譜法測(cè)定蒙藥肉豆蔻五味中4 種藥效物質(zhì)的含量

安佳斯，閆婷婷，賈 鑫，朱小玲，劉天龍，董 玉*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢查中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065）

肉豆蔻五味是蒙醫(yī)臨床治療心臟病的經(jīng)典方劑。該方源于《蒙醫(yī)藥方匯編》，現(xiàn)收錄于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：蒙藥》[1，2]。該方由肉豆蔻、木香、土木香、廣棗和蓽茇五味藥材組成，用于治療心煩失眠、心神不安、心腦供血不足、缺血性心臟病等[2]。

肉豆蔻屬心臟良藥，又稱(chēng)“匝迪”。其具有抗心律失常、促紅細(xì)胞生成、促進(jìn)缺血再灌注損傷心肌的恢復(fù)、保護(hù)心臟的作用[2，3]，主要成分包括揮發(fā)油和脂肪油等[2]。木香用于胸脘脹痛、瀉痢后重、食積不消、不思飲食等，主要成分包括萜、內(nèi)酯類(lèi)等[3]。土木香又稱(chēng)“瑪奴”，主治感冒頭痛、惡寒等。對(duì)心肌細(xì)胞缺氧損傷有保護(hù)作用，主要成分包括菊糖、萜、內(nèi)酯類(lèi)等[4]。廣棗具有抗心律失常、抗氧化等藥理作用，主要成分包括有機(jī)酸類(lèi)和黃酮類(lèi)等[5，6]。蓽茇又稱(chēng)“必必靈”，其主要成分揮發(fā)油可調(diào)理胃火、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、平喘、祛痰、止痛等[7]。

課題組前期建立了高效液相色譜測(cè)定Santamarine、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯等內(nèi)酯類(lèi)成分的方法[8，9]。蒙藥肉豆蔻五味中含有揮發(fā)性成分，課題組前期未建立對(duì)肉豆蔻五味的氣相色譜檢測(cè)方法以及相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而氣相色譜法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性強(qiáng)。因此，本文通過(guò)建立氣相色譜法測(cè)定肉豆蔻五味中4種藥效物質(zhì)的含量，旨在完善蒙藥肉豆蔻五味的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，為肉豆蔻五味的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

氣相色譜儀（美國(guó)Agilent 7890B，安捷倫化學(xué)工作站）；DZKW-D-2電熱恒溫不銹鋼水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

蒙藥肉豆蔻五味各味藥材：肉豆蔻（批號(hào)：18112702）、木香（批號(hào)：18090403）、土木香（批號(hào)：170801）、廣棗（批號(hào)：190112）、蓽茇（批號(hào)：180901）。以上藥材購(gòu)于內(nèi)蒙古天力藥業(yè)有限公司。甲基丁香酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，111642-200301）；土木香內(nèi)酯（99.4%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院，110760-201811）、異土木香內(nèi)酯（98.8%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院，110761-201806）；去氫木香內(nèi)酯（99.8%）（上海麥克林生化科技有限公司，C11222536）；乙醇（95%）（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠，20190901）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：HP-5 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，1 μm）；高純氮?dú)猓?0 mL/min）；助燃?xì)鉃榭諝猓?0 mL/min）；氫火焰離子化檢測(cè)器溫度280 ℃，進(jìn)樣口溫度230 ℃，分流比9∶1，進(jìn)樣量1 μL；柱溫箱梯度升溫，升溫條件見(jiàn)表1。

表1 柱溫箱程序升溫條件

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制精密稱(chēng)定甲基丁香酚對(duì)照品、土木香內(nèi)酯對(duì)照品、異土木香內(nèi)酯對(duì)照品、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.21 mg/mL、0.606 mg/mL、0.72 mg/mL、0.435 mg/mL的對(duì)照品溶液。分析結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品溶液氣相色譜圖（A:甲基丁香酚；B:土木香內(nèi)酯；C:異土木香內(nèi)酯；D:去氫木香內(nèi)酯）

2.2.2 供試品溶液的制備 按照比例稱(chēng)取肉豆蔻五味10 g，置500 mL 圓底燒瓶中，10 倍量95%乙醇回流提取每次2 h，合并濾液，回收溶劑，定容至5 mL容量瓶。微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 供試品溶液氣相色譜圖（峰1：甲基丁香酚；峰2：土木香內(nèi)酯；峰3：異土木香內(nèi)酯；峰4：去氫木香內(nèi)酯）

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1 μL、1.5 μL、2 μL、2.5 μL、3 μL、3.5 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。以X-Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為色譜峰面積（Y），橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量（X）（μg），計(jì)算各個(gè)化合物的相關(guān)系數(shù)（r）、回歸方程和線性范圍。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 蒙藥肉豆蔻五味中4種化學(xué)成分的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.4 精密度試驗(yàn)

按照“2.2.2”項(xiàng)下制備方法，制備供試品溶液，采用1 份溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次的方法測(cè)定精密度。測(cè)得甲基丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積的RSD%（n=6）分別為2.22%、1.93%、1.72%、2.70%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按照“2.2.2”項(xiàng)下制備方法，同時(shí)制備供試品溶液6份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，將6份制備的供試品溶液注入氣相色譜中分析。結(jié)果甲基丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的平均含量分別為0.0263%、0.158%、0.163%、0.058%；RSD%（n=6）分別為1.97%、2.42%、2.81%、2.63%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照“2.2.2”項(xiàng)下制備方法，制備供試品溶液1份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h檢測(cè)，測(cè)得甲基丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積的RSD%（n=6）分別為2.85%、1.90%、2.12%、1.43%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液于24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)定6 份肉豆蔻五味藥材各5 g，分別加入甲基丁香酚1.350 mg、土木香內(nèi)酯8.020 mg、異土木香內(nèi)酯8.200 mg、去氫木香內(nèi)酯3.010 mg，共同定容于5 mL 容量瓶中，得供試品溶液。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率及其RSD 值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果[n（%）]

2.8 樣品含量測(cè)定

取12批不同批次的蒙藥肉豆蔻五味藥材，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各個(gè)批次藥材中4 種成分的含量（見(jiàn)表4）。

表4 12批次樣品的4個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果[n（%），n=3]

3 討論

與前期實(shí)驗(yàn)室制定的高效液相色譜測(cè)定Santamarine、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯等內(nèi)酯類(lèi)成分的方法相比，本文采用的氣相色譜法測(cè)定土木香內(nèi)酯、異木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯等成分可免去樣品前處理的過(guò)程，省時(shí)省力；同時(shí)采用高純氮?dú)庾鳛檩d氣，經(jīng)濟(jì)便捷。且氣相色譜法具有樣品用量少、高分離效能、高度選擇性、高度靈敏性、分析速度快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適合肉豆蔻五味中揮發(fā)性成分的測(cè)定。

課題組優(yōu)化多種實(shí)驗(yàn)方式，以期完善測(cè)定方法。當(dāng)測(cè)定時(shí)間超過(guò)120 min 后，再無(wú)其他色譜峰出現(xiàn)。因此，確定測(cè)定總時(shí)間為120 min。當(dāng)柱溫箱采用等度升溫時(shí)，色譜峰分離度較差；采用梯度程序升溫法時(shí)，可選出化合物最佳出峰溫度。當(dāng)進(jìn)樣口溫度為180 ℃時(shí)，所得色譜峰易出現(xiàn)肩峰，分析原因?yàn)閺?fù)雜基質(zhì)會(huì)對(duì)待測(cè)成分的峰形產(chǎn)生影響；進(jìn)樣口溫度升至230 ℃時(shí)，上述情況消失，因此確定進(jìn)樣口溫度為230 ℃。當(dāng)分流比為9∶1 時(shí)，可在保證待測(cè)成分被準(zhǔn)確檢測(cè)的同時(shí)，排除大多數(shù)基質(zhì)成分對(duì)儀器本身及色譜柱的影響。

課題組測(cè)定了12 批次肉豆蔻五味藥材中甲基丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的含量，含量相對(duì)穩(wěn)定，且4 種成分峰型尖銳、對(duì)稱(chēng)性高，與其他峰的分離度較好，可以作為肉豆蔻五味的質(zhì)量控制方法之一。

肉豆蔻五味中肉豆蔻為君藥，研究表明肉豆蔻可消減動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，使全血黏度含量減少[10]。同時(shí)諸多研究表明甲基丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯可在抗炎、抗腫瘤、抗心律失常等多個(gè)方面發(fā)揮藥理作用。其中甲基丁香酚是肉豆蔻的主要成分，具有抗菌、鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化損傷等藥理活性。王宏偉等[11]的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，活性化合物中甲基丁香酚的OB 值大，活性成分-靶點(diǎn)預(yù)測(cè)圖中甲基丁香酚的度值排名較前，對(duì)缺血性心臟病有一定的作用。實(shí)驗(yàn)證明甲基丁香酚可以增強(qiáng)細(xì)胞活性，保護(hù)器官組織，為研究急性器官缺血提供了參考價(jià)值[12]。土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯是從土木香的根中分離出的半萜內(nèi)酯類(lèi)化合物，具有較好的抗炎、驅(qū)蟲(chóng)、抗菌、抗腫瘤等作用[13～17]。土木香內(nèi)酯通過(guò)誘導(dǎo)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和DNA損傷的方式達(dá)到抗腫瘤作用，還可以選擇性地抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的活性，發(fā)揮抗腫瘤活性。王紫潔等[18]研究得出土木香內(nèi)酯通過(guò)阻斷Wnt/β-catenin 信號(hào)通路對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲產(chǎn)生抑制作用的同時(shí)促進(jìn)其凋亡，為治療食管癌提供新思路。異土木香內(nèi)酯的抗腫瘤作用近些年備受關(guān)注。相關(guān)研究顯示其具有良好的抗腫瘤效果[19]。胡艷玲等[20]通過(guò)體外培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞株，研究得出異土木香內(nèi)酯可有效抑制宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。張秀娟等[21]選取MCF-7細(xì)胞株，通過(guò)MTT 法與SRB法研究得出，異土木香內(nèi)酯對(duì)MCF-7 細(xì)胞具有較強(qiáng)增殖抑制活性，可以通過(guò)PI3K/Akt 途徑和線粒體途徑共同誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞凋亡，從而抑制乳腺癌的發(fā)生。去氫木香內(nèi)酯是木香的主要活性成分，其具有抗腫瘤、抗菌、抗?jié)兊茸饔肹22]。研究表明，去氫木香內(nèi)酯可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增生，還可以抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，達(dá)到抗心血管病的藥效作用[23，24]。

綜上所述，甲基丁香酚、土木香內(nèi)酯、異木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯可作為蒙藥肉豆蔻五味的藥效成分。本研究有利于進(jìn)一步研究肉豆蔻五味的藥效關(guān)系，為肉豆蔻五味的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。