miR-29c 和miR-93 在卵巢癌患者血清中的表達及其臨床意義

于聰祥，李躍飛，劉亞萍*

（1.內蒙古醫科大學附屬醫院婦產科，內蒙古 呼和浩特 010050；2.內蒙古自治區婦幼保健院婦產科，內蒙古 呼和浩特 010012）

卵巢癌（ovarian cancer，OvCa）在全球女性惡性腫瘤中的發病率及病死率位居第四[1]，約85%卵巢癌發現時已經處于中晚期[2]，5 年總生存率低于30%[3]，預后相對較差，并且有年輕化趨勢。目前國內外面臨的瓶頸是缺乏有效的篩查手段，難以對卵巢癌進行早期診斷以及精準治療。研究發現上皮性卵巢癌的發生發展及浸潤轉移與p53突變率、p16和Ki67的高表達率具有顯著相關性，有助于進行臨床診斷，可能作為診斷和預后的特異性抗體指標[4]。然而p53 突變率、p16 和Ki67 的表達率不能應用于卵巢癌的早期篩查及早期診斷。血清糖類抗原125（cancer antigen125，CA125）是MUC16 基因編碼的糖蛋白，在正常組織中呈低表達或不表達，在卵巢癌惡性腫瘤中卻呈顯著升高趨勢，廣泛應用于卵巢癌的早期診斷。然而其敏感性、特異性相對較低，并且假陽性率相對較高[5]。相當多的患者難以實現早期診斷，而錯失治療時機。微小核糖核酸（micro RNA，miRNA）是在惡性腫瘤中新近發現的一類影響腫瘤轉移、復發的重要生物學標志物。miRNA 是由20～22 個核苷酸組成的一類內源性、不編碼蛋白質的小型非編碼RNA，轉錄后通過靶向互補的DNA 和miRNA 序列調控基因表達[6]。目前的研究熱點主要集中在試圖將miRNA 作為癌癥的早期診斷指標。然而關于miRNA 與卵巢癌的研究仍處于起步階段，miRNA 能否聯合CA125 作為卵巢癌診斷及治療的重要分子標志物，以實現對卵巢癌的二級預防，是亟待解決的重要問題。本課題擬通過測定卵巢癌患者血清中miR-29c、miR-93 表達情況，探討miR-29c、miR-93 在卵巢癌患者中的生物學特性，進而分析其潛在的臨床應用價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2016 年4 月至2018 年1 月內蒙古醫科大學附屬醫院婦產科因卵巢腫瘤住院的患者32例，其中卵巢癌患者20 例（包括卵巢上皮性惡性腫瘤14例、非上皮性惡性腫瘤6 例）、卵巢良性腫瘤（benign ovarian tumor，BT）12 例，所有患者入組前采集血液標本，待術后病理確診方列入相應組別。所有卵巢癌均行卵巢癌根治術。另隨機選取無卵巢腫瘤的正常健康女性（normal healthy women，N）12 例為對照組，采集血液樣本。研究組患者平均年齡（42.52±4.38）歲，對照組平均年齡（41.68±3.86）歲，對照組平均年齡（39.82±4.13）歲，組間比較平均年齡等一般資料差異無統計學意義（P＞0.05），有可比性。所有受試者均簽署知情同意書，且本研究已獲得內蒙古醫科大學附屬醫院倫理委員會批準。入組前未接受放化療或激素藥物治療；不合并自身免疫系統疾病、其他臟器器質性病變及惡性腫瘤等。

1.2 標本采集

收集20 mL血液于EDTA管中，室溫下放置2 h，以3 000 rpm/min離心15 min，離心后將血漿勻漿等分于-80 ℃保存。

1.3 miRNA提取

根據生產商說明，使用QiAzol Lysis Reagent（Qiagen，杜塞爾多夫，德國）裂解血清樣品。將miRNeasy 血清、血漿摻入對照（Qiagen）添加到裂解樣品中進行miRNA提取。具體的提取過程如下：取200 μL 血清樣本，加入5 倍體積的裂解液，渦旋混勻，室溫靜置5 min；加3.5 μL control 工作液，混勻；加200 μL 氯仿，渦旋15 s，室溫放置3 min；4 ℃1 2000 rpm 離心15 min；取上清液至新EP 管，加1.5倍體積無水乙醇，渦旋混勻；將上述溶液移至吸附柱中，室溫1 2000 rpm 離心1 min，棄廢液；加700 μL RWT buffer至吸附柱中，室溫1 2000 rpm 離心1 min，棄廢液；加500 μL RPE buffer 至吸附柱中，室溫1 2000 rpm 離心1 min，棄廢液；加500 μL 80%乙醇至吸附柱中，室溫1 2000 rpm 離心2 min，棄廢液及收集管；將吸附柱置于新的收集管上，室溫1 2000 rpm離心5 min；將吸附柱置于新的EP 管上，加入14 μL RNase-free water于吸附柱中央，靜置1 min，1 2000 rpm離心1 min；提好的RNA放到-80 ℃保存。

1.4 血清miRNA反轉錄

使用Mir-XTM miRNA 第一鏈合成試劑盒（Ta-KaRa，中國大連）。根據生產商說明進行血清miRNA反轉錄，反轉錄反應體系為：5 μL緩沖液、3.75 μLRNA、1.25 μL酶。反應條件如下：37 ℃反應1 h、85℃反應5 min。4 ℃冷卻，用100 μL cDNA，-20 ℃保存。

1.5 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）

qRT-PCR反應體系根據SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）說明制備。每個樣品設置兩個反應孔，并進行3 次平行實驗。反應條件為：預變性（95 ℃，2 min）、變性（95 ℃，2 min）、退火（60 ℃，15 s）、延伸（72 ℃，30 s）、共進行40 個循環。上游引物由上海勝工生物工程有限公司提供。 mRQ 3'Primer作為下游引物（TaKaRa）。秀麗隱桿線蟲miR-39 作為內參基因。采用RT-qPCR 實驗[18]檢測血清中特定miRNA 的相對表達量。將所研究的miRNA 的每個循環閾值（Ct）用內源參考miRNA的Ct（ΔCt）進行標準化，ΔCt=平均值Ct（參考miRNA）-平均值Ct（目標miRNA），特定的miRNA 相對內參基因的相對表達量采用2-Δct值表示。BT 或OvCa 組的每例患者均以正常健康女性組的平均值（N 個）（ΔΔCt）進行標準化。ΔΔCt=平均值Ct（來自N 個正常健康女性miRNA 的平均值）-平均值Ct（來自BT 或OvCa 的miRNA的平均值），特定的miRNAs相對陰性對照組的相對表達量采用2-Δct值表示。

1.6 引物

RT- qPCR 實驗中所用到的引物采用Primer 5軟件和NCBI Primer- BLAST 進行設計，Tm 值在60 ℃上下浮動，引物設計均符合RT-qPCR 正常進行的要求。具體引物見表1。內參基因miR- 39（miRNeasy?Serum/ Plasma Spike- In Control），U6 引物（Mir-X?miRNA First-Strand Synthesis Kit），3′microRNA Primer 通用下游引物（Mir- X?miRNA First-Strand Synthesis Kit）均由試劑盒提供。F 表示上游引物，R表示下游引物。

表1 引物列表

1.7 統計學方法

使用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量數據用（±s）表示，利用t檢驗；計數數據用[n（%）]表示，利用χ2檢驗，組間比較采用秩和檢驗。通過受試者工作特征曲線（ROC）分析miRNA的診斷能力，并計算其下面積（AUC）。檢驗水準為α=0.05，P＜0.05被認為差異具有統計學意義，預后采用Logistics回歸進行分析。

2 結果

2.1 主要指標

本研究共納入44 位受試者，包括20 位OvCa 患者（其中包括上皮性卵巢癌患者14例、非上皮性惡性腫瘤6例）、12位良性卵巢腫瘤患者（BT）和12位正常健康女性（N），以評估外周血中差異表達的miRNA。

2.2 選擇miRNA

根據文獻資料，本實驗選擇8 種miRNA 作為OvCa 患者候選生物學標志物[7～9]，包括miR-29c、miR-93、miR-141、miR-21、miR-200a、miR-200c、miR-494-5p 和miR-let-7f2-5p。資料表明在OvCa患者中，上述miRNA在血清或組織樣本中的濃度均比正常健康女性更高或更低。本研究預實驗應用RT-qPCR檢測了12位卵巢癌患者血清中8種miRNA的表達。結果顯示，OvCa 患者血清中miR-29c、miR-93相對濃度顯著高于BT患者或正常健康女性。因此，后續實驗中選取miR-29c、miR-93 作為OvCa診斷的潛在血清miRNA指標進行驗證（見圖1）。

圖1 各組血清樣品中miRNA的表達情況

2.3 卵巢癌患者血漿中miR-29c 與miR-93 含量高于正常健康女性

本實驗通過qRT-PCR 分別對20 位OvCa 患者血清的每種miRNA（miR-29c、miR-93）進行了3 次測定，將3組獨立實驗的Ct值取平均值，并標準化為內部參比miR-39，以獲得Δct值。如材料和方法[10]中所述計算2-Δct和2-ΔΔct值。通過分析受試者血清樣品中的表達來標準化這兩種miRNA的qRT-PCR數據。

與BT 患者和正常健康女性相比，OvCa 患者血清中miRNA（miR-29c、miR-93）濃度更高。N、BT和OvCa 組中miR-29c 的平均相對濃度分別為0.003、0.015和0.053（見圖2A）。N、BT和OvCa組中miR-93的平均相對濃度分別為0.112、0.345 和0.630（見圖2B）。散點圖顯示，OvCa患者miR-29c和miR-93的血清濃度高于正常健康女性，差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖2）。

圖2 不同組別miR-93濃度含量（OvCa 患者（n=20）、BT 患者（n=12）和正常健康女性（n=12）血清中miR-29c，miR-93的差異表達散點圖）。

2.4 miR-29c、miR-93 結合CA125 在OvCa 中的診斷價值

通過IBM SPSS Statistics 軟件對OvCa 患者血清中的miR-29c、miR-93 和CA125 進行聯合分析。參照正常CA125（＜35 U/mL）范圍，選擇中位數18 U/mL作為正常健康女性組的CA125值，miR-29c、miR-93血清水平的差異顯著，OvCa 患者和健康正常女性miR-29c、miR-93、CA125及其組合的AUC值分別為0.599、0.538、0.893 和0.910。miR-29c、miR-93 與CA125組合可以區分OvCa患者和正常健康女性，敏感性為89%（見圖3）。miR-29c、miR-93、CA125 及其組合的敏感性和特異性由最高的約登指數確定（敏感性+特異性-1）。總之，將miR-29c、miR-93與CA125結合起來作為診斷OvCa的新方法是可行的。

圖3 ROC曲線分析

2.5 miR-29c 、miR-93 結合CA125 對OvCa 預后分析

該實驗所檢測卵巢癌癥20例患者中，隨訪到16例，其中4例因聯系方式改變而失訪，截止到2020年12月31日，所隨訪患者隨訪時間均為≥4年、＜5年，結局變量為是否復發。因變量為是否復發，賦值：0=未復發，1=復發。自變量為miR29C、miR93 和CA125。選擇Logistics 回歸進行分析。經Logistics回歸分析可知，miR29C、miR93 和CA125 對于是否復發沒有影響（P＞0.05）（見表2）。

表2 預后影響因素篩選結果

3 討論

卵巢位于盆腔深處，早期病變不易被發現，目前臨床上缺乏有效的篩查手段。大多數患者出現癥狀前來就診時已進展為晚期卵巢癌。治療效果明顯降低，患者預后差、生存率極低。因此，尋找特異性標志物以實現對卵巢癌的二級預防，早發現、早診斷并進行早期精準治療是改善卵巢癌患者不良預后的關鍵。

miRNA是一組內源性非蛋白編碼RNA，約占人類基因組的1%～5%。其廣泛參與基因的表達和信號通路的調控，主要功能是參與基因轉錄后的調控[6]。miRNA在腫瘤、炎癥等疾病中發揮重要作用，是目前國內外的研究熱點，關于miRNA在卵巢癌發病機制中的研究仍處于起步階段。2020年胡菊梅等通過qRT-PCR 法檢測卵巢癌組織中和正常卵巢組織中miR-29b和miR-187的表達情況，發現miR-29b在卵巢癌組織中呈低表達，而miR-187 呈高表達，提出miR-29b 和miR-187 與卵巢癌的分化程度、淋巴結轉移等臨床病理特征及預后相關，認為miR-29b和miR-187可能共同影響卵巢癌不良預后[11]。國外學者研究發現miRNA-141 在卵巢癌細胞中呈高表達，可促進卵巢癌細胞異常增殖，與卵巢癌轉移及預后有關[12]。miR-519a 通過調控信號通路及轉錄激活因子3（activating transcription factor 3，STAT3）發揮抑癌作用[13]。這表明多種miRNA可能與卵巢癌發生發展、侵襲轉移密切相關。研究表明miR-29c是血管內皮細胞損傷的調節因子，miR-29c 通過靶向結合IGF-1 的3’-UTR，參與調節內皮細胞的細胞循環、增殖和血管形成等[14]。Liu 等[15]研究發現miR-29c 靶向抑制血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，促進內皮細胞的血管參與腫瘤形成。2015年穆鵬等[16]采用qRT-PCR對65 例卵巢癌患者經手術切除的上皮性卵巢癌組織標本進行檢測分析發現，卵巢癌組織中miR-29c表達水平高于正常組和良性腫瘤組。卵巢癌組miR-29c 表達水平與腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結轉移具有相關性，提出miR-29c 在卵巢癌診斷及病情評估方面具有一定應用價值。本研究結果顯示，OvCa 患者血清中miR-29c 的濃度明顯高于卵巢良性腫瘤和正常健康女性的血清濃度（P＜0.05）。這提示miR-29c 可能通過調節血管形成促進卵巢癌細胞增殖侵襲，在卵巢癌的發生發展中起重要作用。通過檢測血清miR-29c 的表達情況可能輔助診斷卵巢癌。

miR-93 是近年發現的位于染色體7922 上的miR-106b-25基因簇，在非小細胞肺癌、子宮內膜癌和乳腺癌組織中呈現高表達[17～19]。研究結果顯示[20]，miR-93 通過調控抑癌基因PTEN 發揮作用，過表達的miR-93 可阻斷細胞凋亡，與結直腸癌相關。miR-93 過表達可以促進鼻咽癌細胞[21]和食管癌細胞[22]的異常增殖，其過表達還與膽管癌的發生及發展密切相關[23]。miR-93 在胃癌組織及胃癌細胞株中的表達明顯升高，過表達的miR-93 可顯著促進胃癌細胞的增殖，并誘導細胞由Go／G1期向S期演進，提出miR-93 通過促進細胞增殖，誘導細胞周期的演進而參與胃癌的形成[24]。這提示miR-93 在癌癥中發揮著促癌基因的作用。課題前期研究，分別在卵巢癌細胞株（A2780）和正常卵巢上皮細胞株（IOSE-80）中提取得到miRNA，并采用qRT-PCR 檢測兩種不同細胞系中miR-93 的相對表達水平，實驗結果顯示miR-93 在卵巢癌細胞系中的水平明顯高于正常卵巢上皮細胞[25]。然而，陳說等[26]研究發現上皮性卵巢癌和卵巢交界性腫瘤中，miR-93的表達水平顯著低于正常卵巢組織，miR-93的表達水平與分化程度及FIGO 分期呈負相關。實驗結果顯示，Lnc RNA TDRG1 通過抑制miR-93 進而解除miR-93對Rho C（ras homolog family member c，Ras同源家族成員C）的靶向抑制作用，從而參與卵巢癌的發生發展。本研究結果顯示，OvCa患者miR-93的血清濃度顯著高于卵巢良性腫瘤組和正常健康女性，差異具有統計學意義（P＜0.05）。這提示miR-93可能抑制細胞凋亡，增強卵巢癌細胞異常增殖及遷移能力，參與卵巢癌的發生發展。通過檢測血清中miR-93的表達水平，可能提高卵巢癌的臨床診斷的準確率。關于miR-93 在血清、卵巢癌細胞系中與卵巢癌組織中表達水平的差異，課題組將在今后研究中繼續探討。

miRNA 在細胞生長、分化過程中發揮著重要作用，對多種癌細胞的增殖、侵襲及轉移產生重要影響[27]。血清中miRNA 具有穩定性、耐受核酸酶活性以及易檢測等優點，可以作為腫瘤的非侵入性的生物學標志物。檢測血液中表達明顯的miRNA 作為惡性腫瘤診斷手段已應用于臨床。然而，迄今為止在臨床上還沒有miRNA 或miRNA 組被用作卵巢癌的生物標記。本研究通過ROC曲線分析結果顯示，miR-29c、miR-93與CA125的結合在診斷OvCa方面比CA125更為靈敏和準確，敏感性為89%。以上結果表明，miR-29c、miR-93 和CA125 的組合可能對卵巢癌的診斷具有潛在臨床意義。

綜上所述，miR-29c、miR-93 可能在卵巢癌的發生發展過程中起重要作用，miR-29c、miR-93 和CA125 的組合提高卵巢癌診斷的靈敏度和特異度，可能對卵巢癌的診斷具有潛在臨床意義。miR-29c、miR-93 或許可以作為預測卵巢癌的生物學標志物。本研究的不足之處在于樣本量不足，在后續研究中，課題組將繼續擴大樣本量，進一步證實該研究的可靠性，并檢測miR-29c、miR-93在卵巢癌血清和癌灶組織中的表達情況，通過體外實驗探究miR-29c、miR-93參與卵巢癌發生發展的分子機制。