酵母鉻對熱應(yīng)激綿羊肝臟組織基因表達(dá)的影響

楊改青 楊斯涵 梁本聰 王林楓* 付 彤 廉紅霞 張立陽 高騰云

（1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗室與設(shè)備管理辦公室，河南 鄭州 450046；2．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046）

鉻是人和動物機(jī)體所必需的一種常見的微量元素，在調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、提高生產(chǎn)性能和胴體品質(zhì)、增強(qiáng)動物的免疫反應(yīng)、改善糖和礦物質(zhì)代謝等方面具有一定的積極的作用[1]。三價鉻包括無機(jī)鉻（氧化鉻、氯化鉻）和有機(jī)鉻（蛋氨酸鉻、毗陡甲酸鉻、煙酸鉻和酵母鉻）[2]。酵母富含蛋白質(zhì)、核酸、糖原、生物素、B 族維生素、膽固醇等多種活性物質(zhì)，營養(yǎng)價值高[3]。酵母鉻是以酵母菌作為載體，通過一定的工藝與無機(jī)鉻培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，通過生物轉(zhuǎn)化的方式將無機(jī)鉻同化在有機(jī)生物大分子上，進(jìn)而轉(zhuǎn)化生物活性、吸收率低的無機(jī)鉻，使其更易被動物吸收的一類物質(zhì)[4]。酵母鉻在參與畜禽營養(yǎng)代謝[5]、緩解動物應(yīng)激反應(yīng)、提高機(jī)體免疫力、降低脂肪沉積、增加不飽和脂肪酸含量[6]、改善繁殖性能[7]、提高胴體品質(zhì)[8]、提高生產(chǎn)性能[9]等方面均具有一定作用。熱應(yīng)激會影響畜體的抗氧化酶活性，使畜體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[10]。酵母鉻還可以增強(qiáng)胰島素與特定的受體和組織的結(jié)合，增強(qiáng)胰島素在蛋白質(zhì)代謝、能量代謝、脂肪代謝、脂肪沉積和膽固醇中的作用[11]，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的酸堿平衡達(dá)到提高畜體免疫力的目的。目前，有關(guān)酵母鉻對畜體作用的研究多集中于細(xì)胞的生長和繁殖，對肝臟作用的報道則較少。肝臟作為儲存活性鉻的器官，對畜體的鉻含量很敏感，因此需要探討日糧中酵母鉻對動物肝臟代謝、熱應(yīng)激和免疫相關(guān)基因的表達(dá)的影響。本試驗對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步的挖掘，為進(jìn)一步揭示生物合成路徑及調(diào)控機(jī)制、關(guān)鍵酶基因功能研究等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

試驗于2018年7月8日—8月26日，在河南省洛陽龍須坡農(nóng)牧有限公司養(yǎng)殖基地進(jìn)行。預(yù)試期5 d，正式試驗期45 d。選擇5～6 月齡，體重相近、健康狀況良好的“杜×湖”雜交（杜泊公羊與湖羊母羊交配）綿羊14只，隨機(jī)分為對照組（基礎(chǔ)日糧，CTL組）、酵母鉻組（基礎(chǔ)日糧+0.5 mg/kg 酵母鉻，Cr 組），每組7 個重復(fù)，每個重復(fù)1 只羊。酵母鉻由河南某有限公司提供，鉻含量0.002 25%，蛋白質(zhì)含量47.6%，水分含量4.2%，粗灰分含量6.4%。參照NRC（2007）[12]飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制日糧，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

對圈舍進(jìn)行統(tǒng)一打掃并進(jìn)行消毒，羊進(jìn)行統(tǒng)一驅(qū)蟲，試驗期間測定圈舍內(nèi)溫濕度[7]。各組羊分圈飼喂，每天7：00、16：30各飼喂一次。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 熱應(yīng)激的判斷與評價

熱應(yīng)激程度用溫濕度指數(shù)（THI）衡量。

式中：T為溫度（℃）；RH為相對濕度（%）。

1.2.2 生長性能

預(yù)飼期連續(xù)3 d對空腹?fàn)顟B(tài)的羊進(jìn)行稱重，試驗結(jié)束再次進(jìn)行稱重，計算每只羊的平均日增重、平均日采食量、料重比。

1.2.3 屠宰性能

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，試驗動物24 h 禁食，12 h 禁水，稱重后進(jìn)行屠宰，計算胴體重、屠宰率等屠宰指標(biāo)。

1.3 肝臟組織轉(zhuǎn)錄組

1.3.1 組織樣品采集

屠宰后，從每組選取4 個樣品用作轉(zhuǎn)錄組測序的綿羊肝臟組織樣品，于-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于RNA的提取。

1.3.2 測序樣品的RNA提取、文庫構(gòu)建及文庫檢測

提取肝臟組織樣品的RNA，通過Nanodrop檢測RNA純度（OD260/280nm、OD260/230nm），通過Agilent 2100對RNA片段長度進(jìn)行檢測。文庫質(zhì)檢合格后，按照根據(jù)文庫有效濃度及測序讀長進(jìn)行測序。RNA-Seq 文庫構(gòu)建和測序利用Illumina二代高通量測序平臺進(jìn)行測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)過濾、組裝及差異表達(dá)分析

為保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量，需要過濾去除2 個樣本的原始序列中包含的接頭或者低質(zhì)量序列。處理以后獲得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)選擇Tophat2軟件進(jìn)行參考基因的比對。基于Wallenius non-central超幾何分布，采用GO seq軟件進(jìn)行GO（gene ontology）富集分析。以KEGG 數(shù)據(jù)庫中Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個轉(zhuǎn)錄組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著性富集的Pathway。

1.3.4 實(shí)時熒光定量PCR驗證

提取6 個樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)SYBR Premix EX TaqTM試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR 驗證，以GAPDH為內(nèi)參基因，實(shí)時熒光定量PCR 引物設(shè)計見表2。

表2 實(shí)時熒光定量PCR引物設(shè)計

采用2-△△Ct法計算各基因的表達(dá)量，對8個隨機(jī)選擇的差異基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR驗證，與RNA-Seq測序結(jié)果相比較，檢測RNA-Seq測序數(shù)據(jù)是否可靠。挑選與熱應(yīng)激、免疫相關(guān)的3 個差異基因，通過RT-qPCR 檢測基因的相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 進(jìn)行初步整理，SPSS 24.0 軟件進(jìn)行分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗期間THI變化情況（見圖1）

圖1 試驗期間THI變化情況

由圖1 可知，整個試驗過程中THI 均大于72（最低74，最高85），表明試驗羊處于熱應(yīng)激狀態(tài)。

2.2 酵母鉻對綿羊生長性能的影響（見表3）

表3 酵母鉻對綿羊生長性能的影響

由表3 可知，試驗結(jié)束時，Cr 組綿羊末重較CTL 組增加了5.06%（P＞0.05）。Cr組綿羊平均日增重與CTL 組相比有所下降，但差異不顯著（P＞0.05）。Cr組綿羊平均日采食量與CTL組相比有所增加（P＞0.05）。

2.3 酵母鉻對綿羊屠宰性能的影響（見表4）

表4 酵母鉻對綿羊屠宰性能的影響

由表4 可知，Cr 組綿羊宰前活重、大網(wǎng)膜重、腎周脂肪重、屠宰率與CTL 組之間均差異不顯著（P＞0.05），Cr組胴體重顯著高于CTL組（P＜0.05）。

2.4 肝臟組織測序數(shù)據(jù)過濾

測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)通常會帶有少量接頭污染及較低質(zhì)量的讀長片段，通過過濾原始數(shù)據(jù)從而得到干凈的序列，以免對后續(xù)數(shù)據(jù)分析造成影響。8個樣品的測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見表5。由表5 可知，Q20、Q30 含量均在90%以上，說明測序數(shù)據(jù)良好，可滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

表5 8個樣品的測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

2.5 肝臟組織差異表達(dá)基因篩選（見圖2）

圖2 差異基因火山圖

顯著性差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為log2倍性變化≥2和P＜0.05。由圖2可知，試驗共篩選出821個差異表達(dá)基因，340個基因表達(dá)量上調(diào)，481個基因表達(dá)量下調(diào)。

2.6 差異基因的GO分析（見圖3）

圖3 差異表達(dá)基因GO富集分析

按照GO 功能分類，將GO 注釋分為3 大類，分別為生化過程、細(xì)胞組分和分子功能。由圖3 可知，本試驗結(jié)果主要集中在生化過程。

2.7 基因的KEGG功能分類

對差異基因進(jìn)行KEGG 分析，前20 個顯著富集的通路見圖4。由圖4可知，差異基因主要富集在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、吞噬體等通路。

圖4 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

2.8 差異表達(dá)基因?qū)崟r熒光定量PCR驗證（見圖5）

圖5 差異表達(dá)基因的實(shí)時熒光定量PCR驗證

通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選、功能注釋及富集分析后，從中篩選出8 個差異表達(dá)基因，分別是C4BPA、HSD17B6、GRIA1、ZEP42、KCNT2、TNFRSF9、TMED2、ELAVL2。以GAPDH為內(nèi)參基因，對上述8個差異表達(dá)基因進(jìn)行RNA-Seq驗證。定量結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢與測序結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在篩選差異表達(dá)基因上較為可靠。

2.9 酵母鉻對綿羊免疫、熱應(yīng)激相關(guān)因子基因表達(dá)的影響（見圖6）

圖6 差異基因的實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果

由圖6可知，與CTL組相比，Cr組CD80表達(dá)量有所增加，但差異不顯著（P＞0.05）。Cr 組CD86 顯著低于CTL組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 酵母鉻對綿羊生長性能的影響

當(dāng)動物產(chǎn)生應(yīng)激時，機(jī)體會產(chǎn)生大量的葡萄糖代謝產(chǎn)物，以對抗應(yīng)激；而血糖的升高會導(dǎo)致鉻的動員量升高，被調(diào)動的鉻無法再被吸收，隨著尿排出體外，即給予高強(qiáng)度的鉻可以提高動物的抗性[13]。Cr3+是葡萄糖耐受因子，在飼糧中加入鉻復(fù)合物可使胰島素與受體細(xì)胞膜結(jié)合，從而增強(qiáng)糖代謝通路的酶活力，減少糖異生通路的酶活力，提高機(jī)體對葡萄糖的吸收和利用；提高機(jī)體對胰島素的敏感度，參與蛋白合成，促進(jìn)肌肉生長，提高其生長能力[14]。本試驗結(jié)果顯示，與CTL 組相比，添加0.5 mg 的酵母鉻對綿羊的增重?zé)o顯著影響，是否與CTL添加劑量或添加方式相關(guān)還有待探究。

3.2 酵母鉻對綿羊屠宰性能的影響

飼料補(bǔ)充方式、飼喂方式、綿羊的日齡、宰前活重、膘情等均是影響屠宰效果的重要因素，提高屠宰日齡、屠宰前活重對屠宰率有顯著影響。臟器的重量是評價動物身體功能的一個重要指標(biāo)[15]。本試驗中，Cr 組綿羊胴體重顯著高于CTL 組，表明酵母鉻對綿羊生長具有一定促進(jìn)作用；Cr組屠宰率與CTL組相比差異不大，可能是由于試驗組內(nèi)臟器官的重量較大，導(dǎo)致各組屠宰率無顯著差異。

3.3 酵母鉻對綿羊肝臟差異表達(dá)基因的影響

肝臟作為動物體的重要器官，動物的生長發(fā)育、物質(zhì)代謝均與肝臟代謝途徑相關(guān)[16]。動物產(chǎn)生應(yīng)激后體溫調(diào)節(jié)能力會遭到破壞，機(jī)體的免疫力下降[17]，肝臟作為新陳代謝的器官，其解毒能力也會存在下降情況[18]。

RNA-Seq 也被稱為轉(zhuǎn)錄組測序，是近年來逐步發(fā)展的新一代轉(zhuǎn)錄分析技術(shù)。本試驗以綿羊肝臟組織為研究對象進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，獲得原始測序數(shù)據(jù)在8 000萬以上，序列比對率均在80%以上，且Q30也在90%以上，堿基識別準(zhǔn)確率高。以log2倍性變化≥2 和P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出包括340個上調(diào)和481個下調(diào)表達(dá)的基因。通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選、功能注釋及富集分析，選取8 個差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 驗證，結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果趨勢一致，表明了轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在差異表達(dá)基因方面的準(zhǔn)確性及可靠性。

免疫球蛋白超家族成員CD80、CD86 作為T 淋巴細(xì)胞中重要的共刺激分子，在抗原遞呈細(xì)胞（APC）表面表達(dá)，與相應(yīng)配體進(jìn)行結(jié)合并誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞發(fā)揮其功能。細(xì)胞因子IL-4、IL-12、LPS等對CD80、CD86的表達(dá)起一定的調(diào)節(jié)作用[19]。CD80 在接受抗原刺激2～3 d 后表達(dá)量上調(diào)，而CD86在接受刺激之后可迅速上調(diào)[20]。細(xì)胞因子的分泌主要是通過與免疫細(xì)胞表面的相應(yīng)受體與CD80、CD86 結(jié)合，進(jìn)行調(diào)節(jié)發(fā)揮相應(yīng)的作用[21]。本試驗中，Cr 組CD80 在肝臟中表達(dá)量上調(diào)，肝臟作為補(bǔ)體合成的重要器官，這可能是機(jī)體自身的一種保護(hù)機(jī)制，對肝臟起到一定的保護(hù)作用。CD80、CD86 可對以T 淋巴細(xì)胞免疫為主的自身免疫性疾病起到一定的調(diào)節(jié)作用；本研究結(jié)果表明，酵母鉻能夠通過促進(jìn)CD80、抑制CD86 進(jìn)而對T 細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[22]。HSP70 是熱休克蛋白中的一類應(yīng)急表達(dá)的分子伴侶蛋白[23]。HSPA1A不僅是HAP70 家族中的一類誘導(dǎo)型表達(dá)基因[24]，也是目前HSP70 家族中研究最多的一種熱休克蛋白[25]。HSPA1A是熱休克蛋白中最為保守的一種，在各種應(yīng)激條件下均會大量表達(dá)[26]。本試驗中，與CTL 組相比，Cr 組肝臟組織的HSPA1AmRNA表達(dá)量有所增加，表明Cr可提高動物對熱應(yīng)激的適應(yīng)能力。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，日糧中添加適量酵母鉻可改善綿羊的屠宰性能。酵母鉻通過上調(diào)CD80，抑制CD86 進(jìn)而對T 細(xì)胞產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，能夠提高機(jī)體對熱應(yīng)激的適應(yīng)能力，保護(hù)綿羊肝臟免受損傷。