杜氏鹽藻對銅脅迫的轉錄組測序及功能注釋分析

凌娜，徐貴國，李瑋璐，劉小瑞

（哈爾濱商業大學藥物工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076）

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）是一種極端嗜鹽、無細胞壁、營光合自養的單細胞真核綠藻。藻體富含β-胡蘿卜素、甘油、多糖、蛋白質素等多種活性物質，常作為水產養殖中魚、蝦、貝類幼體的餌料[1,2]。銅是細胞內多種酶的活性中心，如質體藍素、銅/鋅超氧化物歧化酶、細胞色素氧化酶、抗壞血酸氧化酶、多酚氧化酶等，參與細胞中光合作用的電子傳遞、葉綠素、維生素以及蛋白質和碳水化合物的生物合成，是植物生長發育必需的微量元素。銅缺乏會導致植物細胞生長受抑，光合作用和呼吸作用速率降低；但銅過量也會對植物產生明顯的毒性效應，如生長不良、光合作用受抑制，嚴重時甚至死亡[3,4]。

采用轉錄組測序技術（RNA-Seq）可以獲得特定條件或狀態下細胞中全部的轉錄本，揭示生物體中一些特殊的生物學現象及其發生機制；分析表達基因差異可從整體上詮釋基因的結構與功能[5]。RNA-Seq 已廣泛應用于植物、動物以及人的各種生理、病理條件下RNA 的測序和分析[6-8]，在植物或藻類中篩查出大量的脅迫導致的差異表達基因，對這些差異基因進行功能注釋和代謝通路分析，可探究植物或藻類響應逆境脅迫的分子機理[9-12]。轉錄組測序技術也應用于杜氏鹽藻的測序和分析中。劉軍立等[13]用RNA-Seq 技術篩查出了杜氏鹽藻中與淀粉和脂質代謝路徑相關的關鍵酶，如磷酸葡萄糖轉移酶、淀粉磷酸化酶、乙酰輔酶A 羧化酶等。朱立強等[14]對杜氏鹽藻全轉錄本進行測序和功能注釋分析，建立了該藻的轉錄組數據庫。高鹽脅迫下的轉錄組分析發現，杜氏鹽藻細胞內與光合作用、碳固定和血紅素生物合成、蛋白質轉換、剪接體、內質網蛋白質加工和內吞作用以及淀粉的降解、甘油的合成等相關的基因顯著上調[15,16]。

鹽藻對銅脅迫的反應是一個極其復雜的生理過程，不僅引起細胞形態學和生理學的變化，還能導致細胞中多個基因和信號通路的改變。本研究基于Illumina HiSeq2500 技術平臺，探討在銅脅迫下杜氏鹽藻的轉錄本在不同信號途徑上的表達，篩查銅脅迫下的差異表達基因，并注釋這些基因的功能和聚類分析，深度挖掘銅脅迫下杜氏鹽藻中與光合作用相關的基因的表達，為揭示鹽藻銅處理下正常的生物學現象和銅耐受的機制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）來源于寧波大學海洋生物工程重點實驗室，采用f/2 培養基，在（24±1）℃，pH 7～8，光強54～90 μmol/（m2·s），光暗周期12h∶12h 下培養。實驗設正常f/2 培養基培養的對照組和銅處理組。前期銅對鹽藻生長72 h 的EC50為9.55 mg/L[17]，選擇與1/2 EC50相當的5 mg/L CuCl2作為銅處理組，培養72 h，每組3 次重復。

1.2 杜氏鹽藻無參轉錄組的構建

1.2.1 RNA 提取及樣品檢測

培養完成時收集鹽藻細胞，采用Invitrogen 公司的Trizol 試劑盒提取藻細胞中總RNA，然后檢測提取的RNA 樣品濃度、純度和長度等質量，確保符合文庫構建標準。

1.2.2 文庫構建

質檢合格后，用帶有Oligo（dT）磁珠富集真核生物的mRNA，然后加入裂解緩沖液，將mRNA 消化成150～200 nt 的短片段；以短片段mRNA 為模板，用6 堿基隨機引物反轉錄合成cDNA 第一鏈，然后合成cDNA 第二鏈，并利用試劑盒純化雙鏈cDNA；純化后的cDNA 進行黏性末端修復，隨后在cDNA的3'-端加上poly-A 并連接接頭，最后選擇片段大小和PCR 擴增構建cDNA 文庫。

1.2.3 文庫質檢

構建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測片段大小，ABI StepOnePlus Real-Time PCR System定量文庫濃度。

1.3 轉錄組測序及生物信息學分析

1.3.1 上機測序及數據質控

轉錄組測序和生物信息學分析委托成都生命基線有限公司和上海美吉有限公司完成。采用Illumina HiSeqTM2500 測序儀進行測序，得到的原始數據參照公司標準進行質控，獲得可用于后續分析的高質量clean reads。Clean reads 經Trinity 軟件de novo 組裝，過濾掉低質量的轉錄本，獲得transcript可用于后續轉錄本注釋和定量分析等。

1.3.2 轉錄本功能注釋

將組裝得到的轉錄本與6 大功能性數據庫（NR、GO、COG、KEGG、Pfam 和Swiss-Prot）比對進行基因注釋，從整體水平評估轉錄本組裝的完整性；同時檢測轉錄本的SNP 和SSR 結構。

1.3.3 差異表達基因分析

基因在轉錄本水平表達的高低是其豐度的直接反應，采用DEGseq 軟件（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DEGseq.html）篩 選 出正常培養及銅脅迫條件下不同樣本中表達量顯著變化的基因，對這些差異基因進行GO 和KEGG Pathway 富集分析。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序

通過Illumina HiSeq2500 對對照組和銅處理組鹽藻的轉錄組進行測序和組裝，篩除冗余序列和短片段后獲得的cleans reads 中分別獲得57 093 個transcripts 和41 418 個unigenes。大多數轉錄本長度分布在200～1 000 bp。Transcript 和unigene 的N50和GC 含量分別為2 306 bp、56.19%和2 118 bp、57.23%。表明測序質量較高，轉錄本適合后續注釋分析。

2.2 功能注釋

對照組與銅處理組鹽藻細胞的轉錄組測序獲得的所有unigene 與NR、GO、COG、KEGG、Swiss-Prot 和InterPro 幾個數據庫進行對比和功能注釋。結果發現有36 422 個unigenes 注釋到這幾個數據庫，其中NR、COG、KEGG、Swiss-Prot 和InterPro 數據庫比對上的unigenes 分別有22 204、19 524、15 345、12 136 和18 016 個，重疊區域共有unigene 7 605 個（圖1）。

圖1 功能注釋韋恩圖Fig.1 Venn diagram of functional annotation

2.3 物種同源性比對

在NR 數據庫中，對獲得的unigene 的同源性比對發現，注釋的unigene 與變異小球藻（Chlorella variabilis）、胸狀盤藻（Gonium pectorale）、長棘卷尾藻（Volvox carteri f.nagariensis）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtli）、亞橢圓球藻C-169（Coccomyxa subellipsoidea C-169）、原鞘小球藻（Auxenochlorella protothecoides）的同源性較高，分別達到25.60%、14.02%、12.02%、10.42%、7.29%和7.08%；與綠色杜氏藻（Dunaliella viridis）和杜氏鹽藻（Dunaliella salina）的相似性僅為1.42%和0.92%（圖2）。原因可能是在公共數據庫中鹽藻的全基因組序列和注釋信息尚不全面，有很多unigene 沒有被比對上，導致同源性比對時同物種的相似性較低。

圖2 物種同源性比對Fig.2 Homology comparison of species

2.4 COG 注釋

基于COG 功能注釋，19 524 個unigene 主要參與代謝、細胞過程及信號、信息的儲存與加工及其他4 個大類，又被細分為22 個類別，其中最豐富的類群是“翻譯后修飾、蛋白折疊、伴侶（1 418）”、“翻譯、核糖體結構和生物起源（862）”、“復制、重組和修復（841）”、“胞內運輸、分泌和液泡運輸（836）”、“信號轉導機制（760）”和“轉錄（594）”。另外，還參與糖類轉運和代謝、氨基酸轉運和代謝、能量的產生和轉換、無機離子轉運和代謝、脂類轉運和代謝、輔酶轉運和代謝的unigene 分別為585、563、509、429、359、286。尚有10009 個unigene 功能未知（表1）。

表1 COG 功能注釋Tab.1 COG functional annotation

2.5 差異表達基因聚類分析

采用DESeq2 軟件對獲得的基因/轉錄本進行差異表達分析，篩選條件為Padjust<0.05，|log2FC|≥1。結果在銅處理組和正常培養組的鹽藻細胞中共篩選出3 799 個差異表達基因（DEGs），其中表達上調的基因為2 350 個，表達下調的基因為1 499 個（圖3-A）。根據FPKM 值進行表達模式聚類分析，紅色代表unigene 在樣本中表達量較高，藍色表示表達量較低。圖3-B 為3 799 個差異表達基因熱圖分析，其中基因結構和功能相似的基因聚為一類，這些基因群可能在鹽藻生命活動及新陳代謝中發揮類似的功能。

圖3 差異表達基因統計及模式分析Fig.3 Statistics and pattern analysis of differentially expressed genes（DEGs）

2.6 差異表達基因的GO 富集分析

采用Blast2GO 軟件對銅處理后的差異表達基因進行GO 富集分析，發現有1 719 個差異表達基因（DEGs）富集到GO 的三個類別。在生物學進程（Biologcial process，BP）中，差異表達基因主要富集在DNA 代謝進程（DNA metabolic process,194）、細胞對脅迫和刺激的響應（Cellular response to stress and stimulus，126 和128）、細胞周期進程（Cell cycle process，65）、染色體組織（Chromosome organization，57）、DNA 復制（DNA replication，45）、有絲分裂細胞周期進程（Mitotic cell cycle process，34）、組蛋白磷酸化（Histone phosphorylation，9）、端粒組織和維持（Telomere organization and maintenance，36）、細胞周期檢測點（Cell cycle checkpoint，21）、結構內穩態（Anatomical structure homeostasis，18）。在細胞組分（Cellular component,CC）中，差異基因主要參與膜組分（Integral component of membrane，812）、質體（Plastid，129）、葉綠體（Chloroplast，122）的合成。差異基因的分子功能（Molecular function,MF）主要富集在DNA 結合（DNA binding，226）、RNA 聚合酶活性（RNA polymerase，28）、組蛋白甲基轉移酶活性（Histone methyltransferase activity，43）等（圖4）。

圖4 差異表達基因的GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

2.7 差異表達基因的KEGG 富集分析

將銅處理后的差異表達基因進行KEGG 富集分析，以P<0.5 為篩選條件，-log10（P-value）和DEGs 數量為橫坐標（圖5）。差異基因顯著富集的途徑為光合作用（Photosynthesis，25）、DNA 復制（DNA replication，26）、RNA 聚合酶（RNA polymerase，21）、同源重組（Homologous recombination，27）、嘧啶代謝（Pyrimidinemetabolism，39）、嘌呤代謝（Purinemetabolism，39）等，說明銅處理主要影響鹽藻細胞的生長、遺傳發育和基礎代謝。

圖5 差異表達基因的KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.8 與光合作用及糖酵解相關的差異表達基因

KEGG 富集分析表明，銅處理顯著誘導了與光合作用及糖代謝相關基因的表達。這些基因主要與光系統膜蛋白復合物、光合電子傳遞鏈、天線蛋白、碳固定和糖酵解等有關。在銅處理下PSII 蛋白復合物編碼基因psbA、psbB、psbC、psbE、psbH、psbM、psbP、psbO、psbZ 以及PSI 蛋白復合物psaC 表達上調。編碼細胞色素b6/f 復合物亞基的基因petB 和petC 表達上調，而編碼PetH 蛋白的基因表達下調。編碼ATP 合成酶α、β 和c 亞基的3 個基因表達也上調。而編碼光捕獲復合物葉綠素的基因lhca3和lhcb4 表達上調，lhca1 和lhcb2 的基因表達下調（表2）。這些基因在光合作用電子傳遞和ATP 合成中發揮重要作用。銅是光合作用中電子傳遞體質體藍素的活性中心，通過蛋白質中銅離子的氧化還原變化來傳遞電子。本研究結果表明，適量的銅能顯著激活鹽藻細胞中PSI-LHCI 超復合物，加快光合電子傳遞，促進鹽藻的生長和光合作用。

表2 與光合作用及糖酵解相關的DEGs 表達Tab.2 Expressions of DEGs related to photosynthesis and glycolysis

銅處理還影響鹽藻細胞中與碳固定及糖酵解相關的基因表達，如編碼核酮糖1,5 二磷酸羧化酶大亞基（RbcL）、轉酮醇酶（TktA）、蘋果酸脫氫酶（Mdh1）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（Gapdh）、磷酸丙糖異構酶（Tpi）的基因表達上調，而編碼檸檬酸合成酶（Cs）、琥珀酸脫氫酶（Sdh）、丙酮酸激酶（Pyk）的基因表達下調（表2）。結果表明，適量的銅可以促進鹽藻細胞中碳代謝及糖酵解過程，加速細胞的碳同化作用。

2.9 與離子轉運及脅迫相關的差異表達基因

植物和藻類已經進化出一個復雜的自穩態網絡系統，調節細胞內外銅的攝入、運輸、分配及銅脅迫響應系統。銅的攝取和轉運過程中有多種蛋白參與，包括銅轉運蛋白、金屬伴侶蛋白、P 型ATP 酶等[18]。由表2 可知，編碼銅轉運蛋白P1B-型ATPase 的基因copA、copB，鋅鐵轉運蛋白基因zip，及液泡轉運蛋白的基因vps-4 和vps-36 表達上調。與ABC 超家族跨膜轉運相關的基因表達也升高，主要有抗氧化防御系統和熱休克蛋白/分子伴侶。銅脅迫還激活了鹽藻細胞中抗氧化防御系統及熱休克蛋白網絡，表現為編碼Cu/Zn-SOD 和過氧化氫酶Cat 的基因顯著上調；熱休克蛋白/分子伴侶網絡中hsp20、hsp33、dnaK 和dnaJC13 的基因顯著上調，而hsp70、groEL、dnaJC7 和dnaJC11 的基因顯著下調（表2）。

2.10 基因結構分析

2.10.1 SSR 標記分析

簡單重復序列（Simple sequence repeats，SSR），又稱為短串聯重復序列（simple tandem repeats,STRs）或微衛星標記（microsatellite），是一類由幾個核苷酸（1～6 個）為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的重復序列，廣泛分布于真核生物基因組中，也是目前應用最廣泛的分子標記技術之一。本研究發現41 418 條unigene 序列中各種SSR 位點18 097個，SSR 發生頻率為43.69%。從SSR 重復類型中發現，杜氏鹽藻轉錄組中出現最多的是三核苷酸重復，占總SSR 位點數目的65.64%；其次是單核苷酸重復和雙核苷酸重復，分別占總SSR 位點數量的13.65%和18.68%。在三核苷酸重復中，AGC/CTG 這種SSR 重復位點最多，占87.51%；其中重復次數為1～5 和6～10 的SSR 位點最多，分別占總SSR 的23.98%和56.78%（圖7）。這些重復序列可作為杜氏鹽藻獨特的分子標記，用于后續SSR 引物設計、基因定位、譜系分析、親緣關系鑒定等。

圖7 杜氏鹽藻中SSR 重復基元的類型Fig.7 SSR repeat motifs in green alga Dunaliella salina

2.10.2 SNP 位點分析

單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）指堿基序列上單個核苷酸的變異，包括轉換、顛換、插入和缺失，是第三代分子遺傳標記技術，可用于分析基因功能與表型性狀之間的關系。目前尚未有關于杜氏鹽藻SNP 標記的相關報道。本研究中，杜氏鹽藻轉錄組分析共有41 418 條unigene，檢測到35 282 個SNP 位點，平均每條unigene 含有0.85 個SNP 位點，其中轉換22 884 個（64.86%），顛換12 398 個（35.14%）。6 種單核苷酸變異中，A-G 和C-T 發生的頻率最高，分別達到33.33%和31.52%；其他4 種單核苷變異中，A-C、A-T、C-G 和G-T 的頻率分別為10.47%、7.18%、7.07%和10.42%（圖8）。本研究極大地豐富了杜氏鹽藻SNP 的位點信息，為后續鹽藻分子遺傳和表型性狀的分析提供一定的參考依據。

圖8 杜氏鹽藻中SNP 位點分析Fig.8 SNP site analysis in green alga Dunaliella salina

3 討論

銅是植物和藻類生長所必需的一種微量金屬元素，廣泛存在于水體和土壤環境中，高濃度時對水生和陸地生物具有一定的毒性。銅對杜氏鹽藻的生長、光合色素的合成、蛋白質和多糖的含量等均有一定的影響[17]，低濃度下促進藻類的生長，高濃度下抑制藻類的生長，表現出典型的hormesis 效應[19,20]。但是，銅脅迫對杜氏鹽藻基因表達和信號通路的影響以及銅的轉運和代謝等機制目前尚不清楚。

本研究通過RNA-Seq 技術從轉錄水平探討杜氏鹽藻基因表達與銅脅迫之間的關系。從對照組和銅處理組共得到41 418 個unigenes，篩選出3 799個差異表達基因，其中2 350 個基因表達上調，1 449個基因表達下調。這些差異表達基因主要富集在光合作用、DNA 復制、RNA 聚合酶、同源重組等基礎代謝過程。光合作用中與光系統膜蛋白復合物、光合電子傳遞鏈、ATP 的合成、碳固定、糖酵解等相關的基因表達上調。結果表明，一定濃度的銅離子可以促進鹽藻的生長和光合作用，而光合作用的增強反過來提高鹽藻對銅的耐受性。

植物和藻類細胞中，銅的同化和運輸受到銅轉運體CTR/COPT 家族的調控，并通過P-型ATPase泵入細胞進行跨膜運輸[21]。本研究發現，銅處理可特異性地激活一系列編碼銅轉運蛋白、ABC 轉運體、液泡轉運蛋白、抗氧化防御系統及熱休克蛋白超家族基因的表達。結果表明，銅可以通過銅轉運體或伴侶轉運到細胞中，然后轉移到葉綠體中的質體藍素，最終導致光合作用和碳代謝的增強。另一方面，細胞中過量的銅可以通過液泡轉運體被泵入或泵出細胞。

本研究與其他類似的研究報道結果一致。Beauvais-Flück 等[21]報道，在10-6mol/L 銅環境下暴露2 h 后，萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和伊樂藻（Elodea nuttallii）共有1 397 個和1 258 個基因差異表達。這些基因主要參與能量代謝、離子轉運、細胞過程、應激、抗氧化代謝和發育等。氧化戊糖磷酸途徑、硝酸鹽代謝和金屬處理等代謝過程僅在伊樂藻中被發現，而細胞運動、多胺代謝、線粒體電子傳遞和三羧酸循環等為萊茵衣藻所特有。銅和H2O2脅迫處理可誘導褐藻長囊水云（Ectocarpus siliculosus）發生氧化應激，表現為激活oxylipin 信號通路，抑制肌醇信號通路。銅脅迫特異性地激活了一系列編碼ABC 轉運蛋白、P1B 型ATP 酶、ROS 解毒系統等基因的表達，誘導游離脂肪酸含量的增加[22]。另有研究發現，杜氏鹽藻通過提高光合作用、碳固定、蛋白質合成等基因的表達增強其耐鹽性[16]。

與此同時，預測和鑒定差異基因功能時，發現僅有55.04%的基因有明確的功能注釋信息，尚有39.04%的差異基因功能未知。杜氏鹽藻基因組信息尚未完全解析，提示這些未知基因可能是新基因，它們在鹽藻銅耐受方面可能發揮重要作用。這方面有待于進一步的挖掘和探討。課題組計劃在下一步實驗中，針對杜氏鹽藻中與銅脅迫相關的路徑如光合作用、離子轉運、氧化應激、逆境脅迫等相關的基因和代謝通路進行深入的挖掘和剖析，并進行基因表達分析和功能驗證，明確銅脅迫對杜氏鹽藻的生長及代謝活動的影響。本研究結果可為深入的探索和挖掘新基因、揭示新基因的功能以及鹽藻銅耐受機制提供一定的理論依據。