顯微介導中國對蝦基因鯉肌肉蛋白差異表達分析

閆學春，張穎，欒培賢

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，淡水魚類育種國家地方聯合工程實驗室，農業農村部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

同位素標記的相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術（簡稱iTRAQ）是美國應用生物系統公司（2004 年）推出的一項技術。該技術的優點在于一次實驗中同時可進行多個樣品的蛋白質組定量比較分析。由于對蛋白樣品的任何肽段都可以進行標記，可大幅度提高鑒定蛋白的覆蓋度和可信度[1-6]。目前，iTRAQ 技術已廣泛應用于蛋白組學的定量研究[7-12]。而隨著鯉基因組計劃的完成，越來越多的鯉新基因已成功克隆，對于所獲得的大量未知基因的功能研究顯得日益重要。如今，生命科學已進入了后基因組時代，系統生物學迅速發展，而蛋白組學是系統生物學的重要技術平臺，是從整體水平上認識蛋白質的存在及活動方式，而轉基因技術則是進行蛋白功能分析和基因表達調控的有力手段[13-15]。本研究依靠顯微介導遠緣雜交技術，將未經遺傳修飾的中國對蝦總DNA 導入鯉（Cyprinus carpio）受精卵內，以期通過這種基因組水平的遠緣雜交技術來改善鯉肌肉的品質[16-18]。在測序前對顯微介導的中國對蝦基因鯉進行AFLP檢測、產物凝膠測序和雙向蛋白電泳分析，通過確定供體基因片段以及肌肉營養成分分析，最終篩選出高氨基酸含量的個體，再通過iTRAQ 技術對這些氨基酸含量高的個體進行蛋白相對定量分析，找到了與氨基酸、脂肪酸密切相關的差異蛋白質，并對這些差異表達蛋白進行GO 功能注釋和KEGG 代謝通路分析[17]。這些研究結果，可為培育顯微介導中國對蝦基因鯉的新品種提供科學依據。

鯉是我國及其他國家重要的淡水養殖的經濟魚類。它具有生長速度快、抗寒能力強等優點，但其肉質欠佳[19,20]，而測定魚類肌肉營養成分是了解魚類肉質的最直接方法。目前對顯微介導中國對蝦基因鯉肌肉品質的研究多集中在肉質指標的常規研究上，而從轉錄和蛋白水平對顯微介導中國對蝦基因鯉肌肉品質的相關基因的研究還不夠深入。因此，有必要對顯微介導中國對蝦基因鯉進行深度測序和蛋白質功能實驗研究，利用現有的轉含鮮味氨基酸基因大片段DNA 基因鯉為基礎，利用蛋白質譜定量技術，篩選顯微介導中國對蝦基因鯉與正常鯉之間的差異蛋白，找出這些差異蛋白與哪些生物學功能相關，為培育出肉質好的鯉新品種提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用魚為本課題組生產的1 齡顯微介導中國明對蝦基因鯉（黑龍江水產研究所生物技術室）和1 齡普通鯉（黑龍江水產研究所呼蘭試驗站）。測序前先通過普通SDS-PAGE 電泳檢測，確定了實驗魚與對照魚有不同的帶型，說明供體基因進入到受體基因組的蛋白表達系統中后，再對這尾實驗魚進行定量蛋白質測序分析。測序樣品為實驗魚和對照魚各取1 尾，體質量分別為228 g 和219 g。由華大基因公司完成測序。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質提取

提取蛋白中所用的試劑為：1 mmol/L PMSF、10 mmol/LDTT、丙酮、2 mmol/LEDTA、0.5 mol/L TEAB。將適量的魚肌肉加入蛋白裂解液溶解，然后依次加入上述各個試劑，通過超聲、離心，然后取上清液用于定量分析。詳細的蛋白提取方法參照文獻[3]。

1.2.2 蛋白質SDS 電泳及酶解

根據華大基因iTRAQ 定量分析報告中提供的方法。SDS 電泳：首先配置12%的SDS 聚丙烯酰胺凝膠，反應條件為95℃5 min，在120 V 恒壓下電泳120 min，電泳前，點樣量為每個實驗魚和對照魚的蛋白樣品各取30 μg，Marker 的點樣量為10 μg，電泳結束后，進行染色和脫色。酶解：各取100 μg 實驗魚和對照魚的蛋白于試管中，分別加入酶和Trypsin（按蛋白和酶20∶1 的比例），在37℃下酶解4 h（第二次酶解8 h）。

1.2.3 iTRAQ 標記

根據華大基因iTRAQ 定量分析報告中提供的方法。將經胰蛋白酶消化后的實驗魚和對照魚蛋白質樣品用真空離心泵抽干肽段，再復溶肽段（0.5 mol/L TEAB），按照手冊進行iTRAQ 標記。

1.2.4 SCX 分離

根據華大基因iTRAQ 定量分析報告中提供的方法。反應試劑為buffer A（25 mmol/L NaH2PO4in 25%A CN，pH2.7）、buffer B（25 mmol/L NaH2PO4，1 mol/L KCl in 25%ACN，pH2.7）；儀 器 采 用 島 津LC-20AB 液相系統；UltremexSCX 柱型號為4.6×250 mm（分離柱）。反應過程為：將經iTRAQ 標記后抽干的各組肽段混合，用buffer A 復溶，再用buffer B（5%、60%、100%）洗脫（214 nm 吸光度檢測），除鹽（StrataX 除鹽柱），最后冷凍抽干。

1.2.5 生物信息學分析

在生物信息分析中，質譜原始文件需要轉換成mgf 格式（sample.mgf）后才能被使用，mgf 文件主要包含了二級質譜（MS/MS）譜圖的信息。本研究中使用Mascot2.3.02 蛋白鑒定軟件。操作時以mgf 文件為原始文件，選擇已建立好的鯉全基因組數據庫，然后用Mascot 進行數據庫搜索和鑒定，對鑒定出的蛋白質用GO 數據庫進行功能注釋分析和分類，再用COG 和KEGG 數據庫對這些蛋白的功能做進一步的分析。

1.2.6 實時熒光定量PCR 檢測差異蛋白基因

將在-80℃冰箱保存的對照魚和顯微介導中國對蝦基因鯉肌肉組織的總RNA 取出，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄獲得cDNA，選取4 個差異表達蛋白（2 個上調，2 個下調），設計引物，以cDNA 為模板，β-肌動蛋白（beta-actin）作為內參基因，擴增條件為95℃預變性5 min；95℃10 s，60℃15 s，72℃20 s，共40 個循環。在AB7500 定量PCR 儀上進行PCR 反應，按照TB GreenTM premix EX TagTMⅡ（Tli RnaseH Plus）（TaKaRa）熒光定量PCR 試劑盒的操作說明書進行，每個試驗樣品重復3 次，取平均值來比較不同樣品基因表達水平。

2 結果與分析

2.1 顯微介導中國對蝦基因鯉的蛋白質鑒定

分別對顯微介導中國對蝦基因鯉和對照魚進行總蛋白提取和iTRAQ 定量分析（圖1），橫坐標為鑒定類別，縱坐標為數量。結果表明，共鑒定得到999 個蛋白，3 760 個肽段，其中含3 280 個Unique肽段。

圖1 顯微介導中國對蝦基因鯉蛋白質鑒定基本信息統計圖Fig.1 Statistical summary of protein identified in common carp micro-injected with total DNA of Chinese shrimp

2.2 顯微介導中國對蝦基因鯉的差異蛋白質鑒定

根據差異倍數>1.2 倍，P<0.05 的差異蛋白質的標準，對比顯微介導中國對蝦基因鯉和對照魚鑒定的總蛋白質。結果表明，與正常組比較，篩選出差異蛋白92 個，表達上調的蛋白質58 個，其中與脂肪酸有關的9 個，與氨基酸有關的2 個，與蛋白有關的1 個，與未知蛋白有關的1 個，與能量代謝有關的16 個，其他29 個；表達下調的蛋白質有34 個，其中與蛋白有關的5 個，與核糖體有關的6 個，與氨基酸有關的2 個，有2 個與未知蛋白有關，其他19 個。

2.3 顯微介導中國對蝦基因鯉的蛋白質GO 功能分析

GO 主要分為細胞組分（Cellular Component）、分子功能（Molecular Function）和生物學過程（Biological Process）等3 個本體，在這3 個本體中共有53 個功能組，其中，細胞組分、分子功能和生物學過程分別含有16、14 和23 個功能組。在細胞組分分類功能中主要體現在細胞器（16.66%）、細胞器部分（11.49%）、細胞（20.30%）和細胞部分（20.30%）；在分子功能分類相關的蛋白質功能主要是結合（44.99%）和催化活性（33.36%）兩部分；而在生物學過程分類中主要集中在細胞過程（14.80%）、單細胞過程（10.81%）和代謝過程（12.53%）（圖2）。

圖2 顯微介導中國對蝦基因鯉蛋白質的GO 分類Fig.2 Gene Ontology（GO）categories pattern of proteins in common carp micro-injected with total DNA of Chinese shrimp

2.4 顯微介導中國對蝦基因鯉的蛋白質COG 功能分析

COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins 蛋白相鄰類的聚簇）是對蛋白質進行直系同源分類的數據庫。研究發現，COG 功能將667 個顯微介導中國對蝦基因鯉肌肉蛋白分為22 類，數量最多的是預測僅有全局功能的101 個蛋白，并有76 個蛋白注釋為能量產生與轉換功能，26 個蛋白注釋為氨基酸轉運和代謝功能，10 個未知功能蛋白。同時發現，功能序列在蛋白質組表達中具有明顯的差異。圖3中的橫坐標為COG 分類條目，縱坐標為功能分類對應的蛋白數量。

圖3 顯微介導中國對蝦基因鯉COG 功能蛋白質的統計數量分類圖Fig.3 COG classifications of unigenes in common carp micro-injected with total DNA of Chinese shrimp

2.5 顯微介導中國對蝦基因鯉的差異蛋白的KEGG 代謝通路分析

通過對顯微介導中國對蝦基因鯉的差異蛋白Pathway 富集分析表明，共有80 個差異蛋白富集于76 個代謝通路，顯著富集于代謝通路、亨廷頓病通路、帕金森氏癥通路、氧化磷酸化通路、脂肪酸代謝、蛋白質消化吸收、賴氨酸降解、色氨酸代謝、核糖體、鈣信號通道、丙酮酸代謝及精氨酸和脯氨酸等12 個代謝通路。其中在精氨酸和脯氨酸代謝通路中，發現CL7255.Contig2_All（肌酸激酶，7.51 倍）發生了上調，在脂肪酸代謝通路中，發現CL4243.Contig1_All（線粒體三功能蛋白，0.59 倍）發生了下調。這兩種蛋白都可能對魚的肌肉發育和提高機體內多種飽和與不飽和脂肪酸含量起重要作用。

2.6 實時熒光定量PCR 驗證

選取CL7255（gi|4027929，肌酸激酶，creatine kinase，上調7.51 倍），U18791（gi|113951767，快速肌球蛋白結合蛋白，myosin binding protein，上調2.78倍），CL4243（gi|148224245，線粒體三功能蛋白，mitochondrial trifunctional protein,下調0.59 倍），U1232（gi|374463379，內皮素，endolepine，下調0.67 倍）4個蛋白質進行實時熒光定量PCR 驗證。結果顯示，圖4 中的2 個上調蛋白和圖5 中的兩個下調蛋白與iTRAQ 的結果一致。

圖4 顯微介導中國對蝦基因鯉相關基因的定量PCR 驗證（上調蛋白）Fig.4 Validation of differentially expressed gene in common carp micro-injected with total DNA of Chinese shrimp（down-regulated protein）by qPCR

圖5 顯微介導中國對蝦基因鯉相關基因的定量PCR 驗證（下調蛋白）Fig.5 Validation of differentially expressed gene in common carp micro -injected with total DNA of Chinese shrimp（down-regulated protein）by qPCR

3 討論

蛋白質是魚肌肉中的主要組成成分，也是構成魚肉組織結構的主要物質。它不僅含有很高的營養價值，而且蛋白質的變化也會影響魚肉品質，因此利用iTRAQ 技術對顯微介導中國對蝦基因鯉的蛋白質進行測序研究，希望能找出與魚肉品質相關的標記蛋白質，這對了解魚肉蛋白質組成特性和結構特性，及鑒定和控制魚肉的品質具有重要意義[21,22]。雖然將iTRAQ 技術用于顯微介導中國對蝦基因鯉蛋白組研究還未見有相關報道，但該技術已成功用于其他魚類蛋白相關的研究中。如向玉婷[23]利用iTRAQ 技術首次對牙鲆（Paralichthys olivaceus）性腺中表達的蛋白進行了測序，鑒定出了1 444 個蛋白，其中上調蛋白118 個，下調蛋白73 個，通過GO和Pathway 分析，鑒定出了牙鲆中的FMR1、CALB2和WDR1 三種蛋白相應的基因，同時進行了Western blot 和熒光定量PCR 檢驗了上述三個蛋白，二者驗證結果一致；陳金濤[24]對長臀（Cranoglanis bouderius）中的未成熟和成熟的精子中蛋白組進行iTRAQ 測序比較，鑒定出了1 941 個可信蛋白質，找到了4 個對精子的發生有重要作用的差異表達蛋白，即PLCγ、PAK、Raf 和GSK-3。Ge 等[25]研究了利用iTRAQ 技術對斑馬魚（Barchydanio rerio var）的卵母細胞成熟過程中蛋白質譜的動態變化。結果發現，有190 個蛋白質在成熟卵母細胞與未成熟卵母細胞中發生明顯變化。Kohn 等[26]對長體多鋸鱸（Polyprion oxygeneion）早期胚胎蛋白質組學分析中，發現了7 種可能作為生物標志的蛋白質。Yihe等[27]利用iTRAQ 技術去分析經鹽度馴化的鰻魚鰓中蛋白質的變化，發現在鹽度為2.5%時，有336 個蛋白表達上調，67 個蛋白表達下調，在鹽度為1%時，有33 個蛋白上調，32 個蛋白下調，并指出了在滲透調節中這些差異蛋白有可能存在著相互作用。iTRAQ 技術還在魚類分子免疫學研究[28,29]、硬骨魚肌間骨骼和肋骨發育的研究[30]和魚類感染菌病的免疫機制[31]等都有很強的應用性。由此可見，利用iTRAQ 技術對魚類進行差異蛋白分析與篩選，已經得到了廣泛的應用[32]。本研究利用iTRAQ 技術，定量分析了顯微介導中國對蝦基因鯉和對照魚的蛋白質差異，通過差異蛋白Pathway 富集分析表明，顯著富集于脂肪酸和氨基酸等代謝通路上的差異蛋白有13 個，其中在精氨酸和脯氨酸代謝通路中發現的上調7.51 倍的肌酸激酶（creatine kinase），在魚類中有促進肌肉發育的作用；而在脂肪酸代謝通路中發現的下調0.59 倍的線粒體三功能蛋白（mitochondrial trifunctional protein），有提高魚體內多種飽和與不飽和脂肪酸的作用[33-35]。

本研究中，在蛋白質測序中篩選到的肌酸激酶（又稱肌酸磷酸激酶，CK）是呱基磷酸轉移酶家族的一員。它是催化某種生化反應發生的酶類，是一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮和ATP 再生有直接關系的重要激酶[36]。肌酸激酶是一種促進ATP 生成的酶，能夠為營養物質的吸收利用儲存能量，能可逆地催化肌酸和三磷酸腺苷生成磷酸肌酸和二磷酸腺苷的反應，在pH 中性條件下，以ATP 生成為主，以保證組織細胞的供能，正向反應利于線粒體內氧化磷酸化生成的ATP，以磷酸肌酸的形式進入細胞液，滿足細胞生理活動之需要，促進細胞和組織的快速生長和發育[37]。在正常的生理狀態下，CK 在細胞內的功能是在肌酸分子上加一個磷酸基因，使肌酸轉化為高能分子磷酸肌酸，為細胞活動提供能量，磷酸肌酸在心肌、骨骼肌及大腦中含量豐富，這個反應由肌酸激酶催化。CK 廣泛存在于骨骼肌、心肌和腦組織中，在脊椎動物中，肌酸與ATP 反應可逆地生成磷酸肌酸，并儲存ATP 的高能磷酸鍵[38]。而魚類CK 的表達上升使催化產生大量的膦酸肌酸，為組織生長提供能量，促進肌肉發育[33]。

本實驗中篩選的另一個蛋白是線粒體三功能蛋白（Mitochondrial trifunctional protein，MTP），在脂肪酸代謝通路中是下調蛋白。MTP 是一種線粒體內膜上的蛋白質，催化脂肪酸β-氧化四個步驟循環中的2-烯酰CoA 的水合、長鏈-3-羥基脂酰CoA的脫氫和β-酮脂酰CoA 硫解的三個步驟，可增加脂肪酸合成的原料，使脂肪酸合成增加[39]。它是由四個α 亞基（HADHA）和四個β 亞基（HADHB）組成，其α 亞單位上有長鏈三羥?；o酶A 脫氫酶，是催化脂肪酸氧化的主要代謝酶，因此其表達下調可抑制脂肪酸代謝，使其產生積累，可提高機體內多種飽和與不飽和脂肪酸含量[34,35]。

綜上所述，從差異蛋白中尋找可能與含鮮味基因表達的相關蛋白，也就是要把一個基因組表達的絕大多數蛋白質進行精確的定量和篩選，從而闡明性狀（高氨基酸）是如何從遺傳證據中產生的原因，這對提高鯉品質的研究具有重要作用，有助于用作新靶點在鯉中發揮重要作用。當然，對這些蛋白的進一步深入研究，需要大量的后續分析及表達、功能水平的驗證。相信隨著分析鑒定工作及功能基因學研究的進一步發展，將會發現更多與品質有關的信號和代謝途徑。iTRAQ 的測序結果進一步表明，鯉胚胎導入顯微介導中國明對蝦全基因組后，肌肉中氨基酸及脂肪酸代謝均發生變化。該技術可應用于結合轉基因技術培育優質的鯉新品種。