血管生成素1通過ErbB1信號通路調節c-Abl介導大鼠慢性術后痛*

潘 鵬 張代玲 俞 靈 袁林芳 趙 贏 陸培春

江蘇省昆山市中醫醫院麻醉科 215300

慢性術后痛(Chronic postsurgical pain,CPSP)的預后與血管生成密切相關,血管生成素-1(Angiopoietin-1,Ang-1)具有血管生成特性,主要與酪氨酸激酶受體結合后激活多種細胞內信號通路發揮作用[1],目前Ang-1參與CPSP的機制尚不明確。表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor-1,ErbB-1)與炎癥介質等結合即可啟動細胞核內的相關基因,從而發揮促血管生成等作用[2],目前尚未見ErbB參與CPSP的相關報道。近年來,人們逐漸認識到炎癥參與CPSP的發生,非受體酪氨酸激酶(c-Abl)參與細胞分化、細胞粘連等過程,據報道,在炎性疼痛模型中,炎癥和氧化應激與c-Abl的過度表達有關[3],但在CPSP這一慢性炎癥過程中c-Abl的表達尚且未知。本研究擬檢測Ang-1、ErbB1、c-Abl 的定位及表達,進一步探討CPSP發生的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由南通大學實驗動物中心提供,倫理委員會批準(20170305-001),體重200～250g,鼠齡8～10周。隨機將60只大鼠分成對照組、假手術組和模型組,每組20只。

1.2 大鼠皮膚/肌肉切口牽拉(Skin/muscle incision and retraction,SMIR)模型的制備 按照Flatters[4]的方法建立大鼠SMIR模型,對照組：不做任何處理;假手術組：麻醉后,無菌條件下在右后肢隱靜脈內側3～4mm處,切割皮膚1.5～2cm后縫合;模型組：在假手術組基礎上暴露淺層肌肉,避開隱神經,將撐開器頭部放入淺層肌肉下撐開至2cm,暴露內收肌筋膜,持續1h后縫合(見圖1)。

圖1 大鼠SMIR模型

1.3 機械性刺激縮爪閾值(Mechanical withdrawal threshold,MWT)檢測 按照Dixon[5]方法測定MWT,von Frey filament纖毛刺激儀(美國North Coast Medical公司)按照剛度力的遞增順序(0.16～26g)垂直刺激術側后爪的足底中部區域,以von Frey輕微彎曲并保持6～8s作為標準,出現縮爪、舔爪及爪子急劇撤回等現象視為陽性反應,否則為陰性。從0.16g開始,升降法記錄5次,有2次或2次以上的反應視為機械性觸誘發痛。若無則用相鄰的大一級力度刺激,如出現2次及以上的陽性反應則給予相鄰小一級力度的刺激,再連續測定5次,間隔30s。對照閾值表查閾值,單位為“g”。

1.4 轉錄組學測序 選取假手術組和模型組術后第7天L3～5脊髓腰膨大組織進行cDNA文庫的制備和RNA測序,由上海中科新生命生物科技有限公司使用Illumina Novaseq 6000/MGISEQ-T7的高通量測序平臺完成。對原始數據通過 perl 腳本進行處理,獲得clean reads。使用HISAT2軟件將clean reads與參考基因組進行比對,獲得mapped reads。使用 Stringtie 軟件對 mapped reads處理,然后使用 Gffcompare 軟件與參考基因組 GTF/GFF 文件進行比較,發現新基因。FeatureCounts計算每個基因的read數,計算FPKM值。使用DESeq2進行差異表達分析,默認篩選閾值為：|log2FC|>1和P<0.05。使用 clusterProfiler R 軟件包進行GO功能富集和 KEGG通路富集分析,當P<0.05 時,認為此GO或者KEGG功能存在顯著富集情況。利用STRING數據庫獲得與基因相對應的蛋白質之間的相互作用關系。

1.5 蛋白質印跡檢測Ang-1、ErbB1、c-Abl蛋白的表達 麻醉后收集術后第7天L3～5腰膨大,全細胞裂解試劑盒(上海生工公司)用于組織樣品蛋白提取。將30μg 總蛋白加載到10%凝膠泳道上(上海生工公司)進行分離。然后使用轉移系統(美國伯樂公司)將分離的蛋白轉移到0.45mm PVDF膜上。在室溫下將膜放在含有5.0% 脫脂奶粉的 Tris 緩沖鹽水和Tween-20封閉溶液中孵育2h,然后在一抗封閉溶液中4.0℃下孵育過夜：Ang-1 (1∶1 000,英國abcam公司)、ErbB1(1∶1 000,美國CST公司)、c-Abl(1∶1 000,英國abcam公司)和GAPDH(1∶5 000,美國Sigma公司)。用Tris緩沖鹽水和 Tween 20(10min/次)洗膜3次,室溫下用羊抗兔二抗(1∶5 000,美國Jackson公司)孵育2h。洗滌后,使用Tanon 2500凝膠成像系統和超敏ECL化學發光檢測試劑盒(愛必信生物科技公司)檢測。使用 Image J分析結果,GAPDH作為內參。

1.6 免疫熒光染色 選取模型組術后第7天大鼠麻醉后,收集L3～5腰膨大,4%多聚甲醛固定,脫水。切成6μm的厚度切片。室溫下用PBS洗滌,5%血清封閉2h,用1%血清稀釋一抗。切片與 Ang-1(1∶100,英國abcam公司)、ErbB1(1∶100,美國CST公司)、c-Abl(1∶100,英國abcam公司)、NeuN(1∶100,美國CST公司)、GFAP(1∶100,美國CST公司)和Iba1(1∶100,英國abcam公司)孵育。4℃過夜,用PBS洗滌10min×3次。用PBS稀釋二抗：Cy3-山羊抗兔IgG(1∶1 000,美國Jackson公司) 和FITC-山羊抗小鼠IgG (1∶1 000,美國Jackson公司)。室溫下避光孵育2h,PBS沖洗15min×3次,封片。熒光顯微鏡進行拍照。

1.7 統計學方法 采用SPSS22.0軟件分析實驗數據,數據以mean±SEM表示。行為學數據采用雙因素重復測量方差分析,事后檢驗采用Bonferroni多重比較分析。Image J軟件分析蛋白質印跡特異性條帶密度以及免疫熒光強度值,多組間比較采用單因素方差分析;兩組間比較采用Student’st-test。P<0.05為差異有統計學意義。所有實驗至少重復3次。

2 結果

2.1 SMIR 后不同時間點MWT 對照組、假手術組和模型組術前MWT基礎值分別為(23.42±1.12)g、(23.16±1.14)g和(22.76±0.87)g,組間無統計學差異(P>0.05)。與基礎值比較,模型組在術后第1、3、7、14天呈進行性下降;與對照組和假手術組比較,模型組顯著降低。見圖2。

圖2 SMIR后不同時間點MWT與對照組比較,*P<0.05;與假手術組比較,#P<0.05

2.2 轉錄組學測序 轉錄組測序篩選差異表達基因(見圖3),對差異表達基因進行KEGG信號通路富集分析(見圖4、圖5),發現Ang-1、ErbB1、c-Abl以及ErbB信號通路差異表達。對差異表達基因進行PPI分析(見圖6),發現Ang-1、ErbB1、c-Abl存在關聯。

圖3 差異基因篩選火山圖

圖4 KEGG信號通路富集分析

圖5 ErbB信號通路圖

圖6 PPI網絡圖

2.3 蛋白質印跡檢測大鼠脊髓中Ang-1、ErbB1、c-Abl蛋白的表達 運用蛋白質印跡分析Ang-1、ErbB1、c-Abl蛋白在脊髄中表達。模型組術后7d脊髄中Ang-1表達降低(見圖7a),ErbB1、c-Abl表達增加(見圖7b～c)。

圖7 大鼠脊髓中Ang-1、ErbB1、c-Abl 蛋白表達變化與對照組比較,*P<0.05;與假手術組比較,#P<0.05

2.4 免疫熒光檢測Ang-1、ErbB1和c-Abl在大鼠脊髓中定位 為研究Ang-1、ErbB1和c-Abl在大鼠脊髓中具體表達于哪些細胞中,選取模型組術后第7天的脊髓組織切片,將Ang-1、ErbB1和c-Abl分別與脊髓中各類細胞標記物進行免疫熒光雙標。結果顯示：Ang-1與NeuN和Iba1共定位,與GFAP不定位(見圖8)。ErbB1與NeuN、GFAP共定位,與Iba1不共定位(見圖9)。c-Abl與NeuN不共定位,與GFAP、Iba1共定位(見圖10)。

圖8 Ang-1在脊髓中的定位(×200,標尺50μm)

圖9 ErbB1在脊髓組織中的定位(×200,標尺50μm)

3 討論

疼痛可能由不同的原因引起,如急性傷害性刺激、炎癥、神經損傷或癌癥,慢性疼痛更是會持續幾周、幾個月或幾年。細胞因子、趨化因子和前列腺素等從脊髓背角激活的小膠質細胞 (Microglia,MG)和星形膠質細胞(Astrocyte,AS)釋放出來發揮重要作用[6]。SMIR模型長時間牽拉皮膚、肌肉組織,能較好地反映術后持續性疼痛過程,模型組術后 MWT 呈時間依賴性顯著下降,術后第7天下降最明顯,表明本實驗成功復制了該模型。

在脊髓損傷后Ang-1通過Tie2受體促進內皮細胞存活,穩定血管,減少白細胞浸潤,減輕炎癥并改善中樞神經系統微環境,阻斷 Tie-2 激活加劇了血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)破壞[7]。本實驗選取模型組MWT 最低的術后第7天為觀察點,發現模型組機械性痛覺超敏,轉錄組測序發現Ang-1表達降低,蛋白質印跡檢測Ang-1蛋白表達降低,表明Ang-1表達下調,可能與BBB通透性增加,炎性介質滲出有關,在CPSP發生過程中發揮重要作用,這與Meng等人[8]證明 Ang-1 過表達減少了BBB泄漏,抑制 BBB 損傷結果一致。在蛛網膜下腔出血大鼠中,給予外源性 Ang-1 可減少 BBB 滲漏[9],這些表明 Ang-1對 BBB 損傷具有保護作用。

Ang-1對體外培養的神經元具有抗凋亡和神經營養作用,發揮著促進神經修復再生的作用,在神經系統中Ang-1 抑制MG的活化,具有保護作用[10]。本課題對大鼠脊髓切片進行免疫熒光染色發現 Ang-1與NeuN共標,與GFAP不共標,與Iba1共標,為Ang-1參與CPSP提供分子生物學基礎。相關研究表明高表達的Ang-1可減輕慢性痛患者痛苦,抑制嗜中性粒細胞彈性蛋白酶可有效緩解脊髓損傷大鼠脊髓中Ang-1的下降,同時緩解由于損傷引起的疼痛[11],表明Ang-1可通過促進小膠質細胞的激活參與CPSP的發生發展。

Ang-1和ErbB激酶,特別是ErbB1,對于γ-氨基丁酸(GABA)至關重要,包括神經元間遷移,軸突和樹突的發育以及突觸的形成。ErbB家族包括四個成員：ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4,ErbB1被激活與酪氨酸激酶有關,它可以在神經炎癥過程中被炎癥介質、趨化因子和細胞因子的信號激活,ErbB1抑制劑可以顯著減少炎癥和小鼠慢性疼痛[12]。本實驗通過轉錄組測序發現ErbB1表達升高,蛋白質印跡檢測ErbB1蛋白表達升高,通過KEGG信號通路顯著性富集分析發現ErbB信號通路,表明ErbB1 和ErbB 信號通路與 CPSP 的發生有關。這與Verma V等人[13]研究的分子遺傳學分析支持ErbB1參與慢性疼痛結果相一致。

據報道,在脊髓中ErbB1優先在膠質細胞中的表達[14]。已有研究發現,在小鼠炎癥性疼痛模型的 DRG中磷酸化的ErbB1被瞬時激活[12]。本課題對大鼠脊髓切片進行免疫熒光染色發現ErbB1與NeuN、GFAP共標,與Iba1不共標,研究結果為ErbB1及ErbB信號通路參與CPSP提供支持。

脊髓中小膠質細胞激活通過 IL-1 信號傳導增加神經元活動來觸發慢性疼痛。Ang-1持續激活巨噬細胞ErbB1受體,抑制PI3K/Akt和STAT3信號通路,減少炎性細胞因子的釋放。本課題研究發現c-Abl與小膠質細胞共定位,KEGG信號通路顯著性富集分析和PPI分析發現Ang-1通過ErbB信號通路調節c-Abl,表明Ang-1可通過ErbB1調控c-Abl,激活小膠質細胞,參與CPSP。

先前的研究表明,在炎性疼痛模型中觀察到c-Abl的表達增加,c-Abl抑制劑降低了膠質細胞的激活和疼痛的過敏性,炎癥和氧化應激與c-Abl的過度表達和激活有關[3]。本課題通過轉錄組測序發現c-Abl mRNA表達升高,蛋白質印跡檢測c-Abl蛋白表達升高,表明c-Abl的表達上調促進了經典的小膠質細胞的促炎激活,通過調節小膠質細胞活化和神經炎癥參與了慢性疼痛的發病過程。本課題不足之處未對Ang-1、ErbB1和c-Abl進行過表達和小干擾處理,仍需進一步深入研究CPSP的具體機制。

綜上所述,Ang-1、ErbB1和c-Abl參與了CPSP發生發展,Ang-1通過ErbB信號通路調節c-Abl在CPSP中發揮重要作用,為CPSP治療提供理論基礎。