基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析miRNA-151a-3p在食管癌中的表達及與免疫細胞浸潤的相關(guān)性

黃恒彬

福建省立醫(yī)院檢驗科,福建省福州市 350001

食管癌(Esophageal carcinoma,ESCA)是世界上常見的惡性腫瘤之一,2018年發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計報告中顯示,ESCA作為常見的惡性腫瘤之一,其占所有癌癥發(fā)病率與死亡率的第7位和第6位[1],且我國ESCA死亡率僅次于胃癌,在各類消化道惡性腫瘤中位居第二,其死亡率占全國惡性腫瘤死亡率的21.8%[2]。近年來,microRNA(miRNA)受到越來越多學者的關(guān)注,其在腫瘤的發(fā)展進程中起著重要的調(diào)控作用,并且其可作為腫瘤無創(chuàng)性診斷的理想標志物[3]。然而miRNA-151a-3p在腫瘤中的作用機制尚罕見研究報道,本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫探討miRNA-151a-3p在ESCA中的表達情況及臨床意義,探索miRNA-151a-3p在ESCA中與免疫細胞浸潤的相關(guān)性,并進行miRNA-151a-3p靶基因預(yù)測及富集分析以期為ESCA的早期診斷及發(fā)病機制提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)下載 從TCGA(https：//cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫搜索并下載ESCA相關(guān)miRNA測序數(shù)據(jù),并對缺失生存資料和臨床參數(shù)的病例進行排除,共納入182例ESCA組織(腫瘤組)與16例癌旁組織(癌旁對照組)的miRNA測序數(shù)據(jù)以及相對應(yīng)的ESCA患者臨床數(shù)據(jù)。

1.2 miRNA-151a-3p在ESCA中的表達 對TCGA數(shù)據(jù)庫下載的182例ESCA組織(腫瘤組)與16例癌旁組織(癌旁對照組)的miRNA測序數(shù)據(jù)使用R軟件limma包進行差異分析處理并使用ggplot2包作圖,獲得ESCA組織與癌旁正常組織miRNA-151a-3p的表達譜。

1.3 繪制ROC曲線及K-M曲線 對獲得的ESCA組織與癌旁正常組織的miRNA-151a-3p數(shù)據(jù)通過R軟件中的pROC包制作受試者工作特征曲線(ROC)評價miRNA-151a-3p診斷ESCA的特異性和敏感性;并使用R軟件中的survminer包繪制K-M生存曲線研究miRNA-151a-3p的表達對ESCA患者預(yù)后的影響。

1.4 免疫細胞浸潤 通過R軟件中的GSVA包ssGSEA算法應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析研究miRNA-151a-3p在ESCA中與免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義且Spearman相關(guān)系數(shù)>±0.3為具相關(guān)性,評價其對腫瘤免疫微環(huán)境的影響。

1.5 miRNA-151a-3p靶基因預(yù)測以及靶基因富集分析 運用Targetscan數(shù)據(jù)庫(https：//www.targetscan.org)對miRNA-151a-3p靶基因進行預(yù)測,通過DAVID在線分析工具(https：//david.ncifcrf.gov/)對預(yù)測得到的靶基因進行GO和KEGG富集分析。按照P<0.05為截取標準篩選GO和KEGG富集分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 兩組樣本miRNA-151a-3p表達量比較 腫瘤組中miRNA-151a-3p的表達量顯著高于癌旁對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖1。

圖1 兩組樣本miRNA-151a-3p表達量比較***表示P<0.001

2.2 評價miRNA-151a-3p診斷ESCA的特異性和敏感性 對獲得的ESCA組織與癌旁正常組織的miRNA-151a-3p數(shù)據(jù)通過R軟件中的pROC包制作受試者工作特征曲線(ROC)評價miRNA-151a-3p診斷ESCA的特異性和敏感性。分析ROC曲線下面積(AUC)結(jié)果為0.814,在ESCA的診斷中具有良好的特異性和敏感性。見圖2。

圖2 miRNA-151a-3p診斷ESCA的ROC曲線

2.3 miRNA-151a-3p的表達對ESCA患者預(yù)后的影響 使用R軟件中的survminer包將182例ESCA患者以miRNA-151a-3p表達量的中位數(shù)為界,分為高表達組(n=91)和低表達組(n=91),比較兩組患者的生存時間,繪制K-M生存曲線研究miRNA-151a-3p的表達水平對ESCA患者預(yù)后的影響。結(jié)果表明miRNA-151a-3的表達水平與ESCA患者的預(yù)后無關(guān),差異無統(tǒng)計學意義(P=0.654>0.05)。見圖3。

圖3 miRNA-151a-3p在ESCA中的生存曲線

2.4 miRNA-151a-3p在ESCA中與免疫細胞浸潤的相關(guān)性 通過R軟件中的GSVA包ssGSEA算法應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析研究miRNA-151a-3p在ESCA中與免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義且Spearman相關(guān)系數(shù)>±0.3為具有相關(guān)性評價其對腫瘤免疫微環(huán)境的影響。見表1。結(jié)果顯示miRNA-151a-3p在ESCA中與樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、NK細胞、Tcm細胞、Th1細胞的浸潤水平呈負相關(guān)性(見圖4)。

表1 miRNA-151a-3p在ESCA中與免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性

圖4 miRNA-151a-3p在ESCA中與樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、NK細胞、Tcm細胞、Th1細胞的浸潤水平呈負相關(guān)性

2.5 miRNA-151a-3p靶基因GO分析和KEGG富集分析 運用Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA-151a-3p靶基因,對預(yù)測到的靶基因進行GO和KEGG富集分析。在生物學過程(Biological processes,BP)方面其主要參與RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的正負調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡等生物進程(見圖5a)。在細胞成分(Cell component CC)方面,其主要分布于細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜等位置(見圖5b)。分子功能(Molecular function,MF)方面,其主要有蛋白質(zhì)結(jié)合、金屬離子結(jié)合、ATP結(jié)合等分子功能(見圖5c)。KEGG富集分析顯示miRNA-151a-3p靶基因主要參與MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、腫瘤中樞碳代謝等信號通路上(見圖5d)。

圖5 miRNA-151a-3p靶基因的GO和KEGG富集分析a.BP分析前10位顯著富集的結(jié)果 b.CC分析前10位顯著富集的結(jié)果 c.MF分析前10位顯著富集的結(jié)果 d.KEGG信號通路分析結(jié)果中顯著富集的通路

3 討論

ESCA是一種常見的上消化道惡性腫瘤,但因ESCA早期癥狀較不明顯,極易被忽略,導致大多數(shù)患者確診時已處于癌癥晚期,5年生存率僅為15%～25%[4-5],因此ESCA早期診斷具有重要的臨床價值。然而目前并沒有一個生物標志物能夠幫助ESCA早期診斷。近年來大量研究表明,miRNAs在血清或血漿中可穩(wěn)定的檢測到,其有望成為腫瘤早期診斷的無創(chuàng)性理想標志物。本文通過研究TCGA數(shù)據(jù)庫中182例ESCA組織(腫瘤組)與16例癌旁組織(癌旁對照組)miRNAseq以及對應(yīng)的臨床數(shù)據(jù),得出miRNA-151a-3p在ESCA中存在異常高表達,并且miRNA-151a-3p作為診斷ESCA的新生物標志物具有較高的特異性及敏感性,然而miRNA-151a-3p作為ESCA預(yù)后標志物并無顯著性。因此,miRNA-151a-3p在ESCA中的診斷價值大于其預(yù)后價值。

腫瘤免疫微環(huán)境中免疫逃逸機制在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起越來越重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-151a-3p在ESCA中與樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、NK細胞、Tcm細胞、Th1細胞的浸潤水平呈負相關(guān)性。樹突狀細胞作為重要的抗原遞呈細胞,在腫瘤免疫微環(huán)境中,其加工和遞呈腫瘤相關(guān)抗原來啟動抗原特異性的T細胞應(yīng)答;反之,腫瘤細胞通過釋放代謝產(chǎn)物、細胞因子等調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境來抑制樹突狀細胞抗原提呈的功能[6]。巨噬細胞是一種具有多種生物學功能的固有免疫細胞,其在腫瘤免疫微環(huán)境的影響下,可表現(xiàn)為不同活化類型;傳統(tǒng)免疫學認為巨噬細胞在腫瘤組織中可發(fā)揮抗腫瘤作用,然而近年有學者研究發(fā)現(xiàn),巨噬細胞巨噬細胞由多個不同的亞群所組成,其表現(xiàn)出的促腫瘤和抗腫瘤功能取決于多種外部因素的作用,如腫瘤微環(huán)境中的細胞因子[7]。肥大細胞是人體中重要的免疫細胞之一,有研究表明在不同的腫瘤中均能檢測到數(shù)量增多的肥大細胞,其釋放的生物活性物質(zhì)可促進腫瘤的發(fā)展以及腫瘤的轉(zhuǎn)移;然而也有研究發(fā)現(xiàn)肥大細胞對腫瘤的形成具有抑制作用,這些成果反映出肥大細胞在腫瘤微環(huán)境中功能的多樣性[8]。NK細胞具有強大的抗腫瘤功能,其不同于T細胞;NK細胞無MHC限制性可直接非特異性殺傷腫瘤細胞,是固有免疫應(yīng)答中重要的一種效應(yīng)細胞。有研究表明與非腫瘤中的NK細胞相比,腫瘤中的NK細胞常伴有激活障礙和抑制功能上調(diào),導致非特異性殺傷腫瘤細胞的功能減弱[9]。Tcm細胞是具有自我更新、分化和長久存活能力的記憶性T淋巴細胞,其負責長久記憶腫瘤抗原,并在腫瘤抗原的刺激下不斷產(chǎn)生針對腫瘤的大量效應(yīng)型記憶性T淋巴細胞,進而分化成為大量的效應(yīng)T淋巴細胞,從而對腫瘤細胞進行殺傷[10]。Th1細胞是發(fā)現(xiàn)的最早一類CD4+輔助性T淋巴細胞亞群,其具有促進細胞免疫、增強抗腫瘤免疫的功能,Th1細胞增殖和分化受到腫瘤免疫微環(huán)境和多種免疫細胞的共同調(diào)控[11]。miRNA-151a-3p在ESCA中的表達上升使得腫瘤免疫微環(huán)境中樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、NK細胞、Tcm細胞、Th1細胞浸潤水平的降低,然而樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、NK細胞、Tcm細胞、Th1細胞是重要的抗腫瘤免疫細胞,其浸潤水平降低將可能導致腫瘤免疫逃逸。因此miRNA-151a-3p可能通過改變免疫細胞浸潤水平促進ESCA的發(fā)生、發(fā)展。

本研究還通過Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA-151a-3p的靶基因,對預(yù)測得到的靶基因進行GO和KEGG富集分析。GO分析結(jié)果顯示miRNA-151a-3p靶基因主要參與調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的正負調(diào)節(jié)、細胞凋亡、蛋白質(zhì)結(jié)合等生物學進程。KEGG分析結(jié)果顯示,miRNA-151a-3p靶基因顯著富集于MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、腫瘤中樞碳代謝等信號通路上。富集分析結(jié)果表明miRNA-151a-3p靶基因參與到腫瘤疾病的進展中,其可能是ESCA惡性化過程中潛在的靶點。

鑒于miRNA-151a-3p在腫瘤中的研究罕見文獻報道,本研究首次通過生物信息學挖掘miRNA-151a-3p在ESCA中的表達情況及與免疫細胞浸潤的相關(guān)性,闡述了miRNA-151a-3p在ESCA發(fā)生發(fā)展中的作用機制。但是以上分析都僅限于TCGA數(shù)據(jù)庫進行的生物信息學分析,仍需要更多的臨床樣本和具體實驗來闡明miRNA-151a-3p促進ESCA疾病發(fā)展的病理機制。