結直腸腺癌中超保守RNA-134的表達及其臨床病理意義*

陸占陽 鄧 彬

1 揚州大學附屬醫院消化科,江蘇省揚州市 225009;2 華東療養院內鏡中心

結直腸腺癌(Colorectal adenocarcinoma,CRAC)是消化系統常見的惡性腫瘤,已成為中國第四大最常見的癌癥,也是第五大癌癥相關死亡的原因[1-2]。隨著先進的醫學診療技術廣泛應用,早發現和早診斷結直腸癌已經取得了很大進展,但大腸癌的生物學機制和潛在生物標志物仍有待闡明,迫切需要研究者們投入大量的研究。超保守RNA(Ultra conservative RNA,UCR)是481個長度超過200bp的DNA片段,在人類、大鼠和小鼠基因組中同源區基因絕對保守(100%一致)[3]。超保守RNA可以轉錄RNA,其轉錄產物稱為T-UCR,在非編碼RNA中,按基因長度的劃分UCR其實是長鏈非編碼RNA(LncRNA)的一個重要類別[4]。根據文獻報道,UCR參與多種癌癥的發生發展過程[5-9]。uc.134作為UCR家族的一員,有文獻報道在肝癌細胞和組織中表達水平異常[9-10],但是關于uc.134的在結直腸腺癌中表達和作用仍不清楚。因此,我們將在本文探討uc.134在CRAC組織中的表達情況、臨床病理意義及其對大腸癌細胞侵襲和遷移的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 81例CRAC及癌旁正常組織來源于2020年1月—2021 年12月揚州大學附屬醫院手術切除的標本,結直腸腺癌診斷由兩位病理科醫師確診。患者年齡范圍42～71 歲,中位年齡為55歲。腫瘤分期參照 2016美國腫瘤聯合會結直腸癌分期系統(第8版),分為Ⅰ期 13 例、Ⅱ期 22例、Ⅲ期 46例。病例納入標準：(1)經病理檢查確診患有結直腸腺癌;(2)入組前未進行手術、化療、放療等抗腫瘤治療;(3)患者臨床病理資料以及隨訪資料完整。排除標準：(1)患有其他器官原發和轉移腫瘤;(2)合并有心、肝、腎等重要臟器功能障礙;(3)合并有血液系統疾病、免疫功能障礙。本研究均經揚州大學附屬醫院倫理與道德委員會批準(2020-15-008),并與患者簽署科研知情同意書。新鮮CRAC組織采集后放入液氮罐里儲存。

1.2 細胞、試劑和質粒 大腸癌細胞株HCT116在本實驗室中維持。癌細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基(HyClone公司)里孵育,培養基中添加100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(Invitrogen公司)。將細胞置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。uc.134-mimic及Scramble對照組、si-uc.134和si-uc對照組均購于上海吉瑪制藥技術公司。使用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen公司)將uc.134模擬物或抑制物等轉染到大腸癌細胞中,實驗組包括uc.134過表達組及Scramble對照組、si-uc.134和si-NC對照組。

1.3 Transwell侵襲遷移實驗

1.3.1 侵襲實驗步驟：首先準備基質膠,將基質膠融化變成液態,按1∶8比例稀釋后覆被Transwell小室底部膜的上室面,放置37℃溫箱30min使得基質膠聚合成凝膠狀態,使用前再進行基底膜水化。然后制備大腸癌細胞懸液,濃度為1×105個/ml。接種細胞：用沒有FBS培養基清洗Transwell小室的上室兩次,在二十四孔板的孔內加入含20%FBS的血清DMEM培養基600μl,把Transwell小室置于24孔內,上室加入100μl體積的細胞懸液,放進培養箱中常規培養癌細胞24h。取出 Transwell 小室,清洗后使用甲醛固定癌細胞30min后,將Transwell小室風干;用0.1%結晶紫將Transwell小室染色20～30min,顯微鏡下隨機選擇5個觀察視野的細胞,并計數穿膜的腫瘤細胞個數,并拍照和統計。

1.3.2 遷移實驗步驟：將200μl DMEM 培養基滴加在Transwell小室的上室(上室覆有直徑8mm的膜),然后加入已轉染的各組大腸癌細胞,數目約2×105個,實驗設有3個復孔。在Transwell小室的下室內加入含有10%FBS 的DMEM細胞培養液,其目的是為了吸引上室內的大腸癌細胞,使得其能穿過上室底層的覆膜。將Transwell小室放置于下室里,放入37℃溫箱,孵育時間24～48h。孵育完后使用甲醛固定,后面的步驟同侵襲實驗步驟。

2 結果

2.1 CRAC中uc.134的陽性表達 通過RNA原位分子雜交實驗得出81例CRAC組織中uc.134主要定位于細胞漿中,少量在胞核中,陽性反應為棕黃(褐)色大小不等、深淺不一顆粒和團塊,陽性比例62/81;而在癌旁正常大腸組織中主要為陰性表達,陽性比例7/81(見圖1)。兩組間陽性比例差異有統計學意義 (χ2=76.367,P=0.000<0.05)。

圖1 RISH檢測uc.134 RNA的陽性表達CRC中uc.134 RNA呈陽性表達,細胞中出現棕黃色顆粒。癌旁正常組織中主要呈陰性表達。放大倍數為10×10

2.2 uc.134陽性表達與CRC臨床特征的關聯性 按uc.134陽性表達分為兩組：陽性表達組(62例)和陰性表達組(19例)。通過統計分析得出uc.134的表達與CRC的病理分級、浸潤深度和淋巴結轉移密切相關(P均<0.05),而與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位和TNM分期之間無相關性(P均>0.05),見表1。這一結果提示高表達的uc.134參與了大腸癌細胞的侵襲和轉移過程。

表1 結直腸癌組織中uc.134陽性表達與臨床特征的關系

2.3 uc.134促進CRC細胞侵襲和遷移 在臨床病理意義中顯示uc.134與浸潤深度、淋巴結轉移密切相關,故本文通過Transwell侵襲遷移實驗對此進行驗證。實驗結果如圖2所示,在侵襲實驗中,過表達uc.134后大腸癌細胞的侵襲細胞數目(81.6±7.24)個明顯多于Scramble對照組(39.65±2.53)個;敲低uc.134表達后大腸癌細胞的侵襲數目(21.82±3.48)個明顯少于si-NC對照組相比(42.4±6.41)個。在遷移實驗中,過表達uc.134后大腸癌細胞的遷移細胞數目(78.6±6.24)個明顯多于Scramble對照組(41.99± 2.59)個;敲低uc.134表達后大腸癌細胞的遷移數目(13.82±2.42)個明顯少于si-NC對照組(43.6±5.44)個。兩組間差異比較均有統計學意義(均P<0.05)。過表達uc.134后大腸癌細胞的侵襲和遷移數目增多,而敲低uc.134表達后的大腸癌細胞的侵襲和遷移數目明顯減少。兩組間差異均有統計學意義(P均<0.05)。

圖2 uc.134對大腸癌細胞的侵襲遷移影響*表示P<0.05

3 討論

結直腸癌(CRC)是消化系統常見的癌癥,也是全世界最常見的死亡原因之一[11-12]。近二十年來,隨著定期體格檢查和內窺鏡技術的普及,結直腸癌及其癌前病變能被早期發現和診斷治療,也使得結直腸惡性腫瘤的發病率和病死率已有明顯的下降態勢[13]。雖然手術切除、放療和化療在治療非分期Ⅳ期大腸癌方面有效,但該疾病最終可能會有近25%的患者進展惡化[14]。因此,研究者們尋找能診斷和治療大腸癌的分子標志物變得至關重要。

在長鏈非編碼RNA中,有一類基因序列在人、小鼠、大鼠和猿等高等生物中保持高度同源性,被命名為超保守RNA(ultra-Conserved RNA,UCR)[15-16],其長度超過200堿基對。目前非編碼RNA的作用和功能已經被大量的研究[17-18],同樣UCR自從被發現以來,它們的功能和作用機理也被逐步研究出來;研究表明UCR的功能主要是與其他RNA結合間接調控功能基因的表達,亦可直接調控功能基因的表達而發揮生物學活性[10,19-21]。

uc.134定位于3q25.32上,基因長度211nt,既屬于UCR,又屬于長鏈非編碼RNA。目前在肝癌中有2個課題組對uc.134進行了研究,例如,Ni 等[10]通過ISH分析顯示。與鄰近肝組織相比,在170個石蠟包埋的肝癌樣品中uc.134的表達異常,且uc.134的表達與患者預后直接相關;uc.134與CUL4A結合并抑制其核輸出,從而介導LATS1泛素化和增加YAPS127磷酸化來抑制肝癌進展。Braconi等[9]使用基因芯片檢測了HepG2的UCR表達譜,結果發現56個UCR在HepG2細胞中異常表達,其中包含了uc.134表達含量增多,但并沒有進一步在大樣本中進行驗證。本文研究結果表明在81例CRC中uc.134的表達含量顯著高于癌旁正常組織,由此推斷uc.134可能發揮促癌基因的作用。進一步分析uc.134表達與CRAC患者臨床特征的關系時發現,uc.134表達與腫瘤浸潤深度、病理分級和淋巴結轉移密切相關,而與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位和TNM分期之間無相關性,這一結果提示uc.134參與了大腸癌細胞的浸潤侵襲和轉移過程,同時也說明在CRC中uc.134表達水平越高,腫瘤細胞分級越低,惡性程度越高,向周圍組織浸潤就越深,進而也就越容易轉移,提示uc.134也是一個促侵襲和轉移的癌基因。

綜上所述,在CRAC組織中uc.134表達水平增高,并與癌細胞的侵襲和轉移密切相關,uc.134扮演著一個致癌且促轉移的基因。本研究可能為大腸癌的今后的診斷和轉移性治療提供一定的理論依據。