基于UGM靶標(biāo)的貴州藥用植物抗結(jié)核分枝桿菌化合物構(gòu)建及類似物研究*

婁華勇, 傅建, 潘衛(wèi)東*

(1.貴州省天然產(chǎn)物研究中心, 貴州 貴陽 550014; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550014; 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 貴州 貴陽 550025)

結(jié)核病是我國乃至世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一[1],死亡人數(shù)居高不下[2-3]。多藥、泛耐藥或全耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株的迅速增加,加上結(jié)核病與艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)并發(fā)感染等情況的出現(xiàn),為本已嚴(yán)峻的結(jié)核病防控形勢(shì)帶來了新挑戰(zhàn)[4-5]。具有全新作用機(jī)制及高效低毒的抗結(jié)核新藥的研發(fā)將是解決這個(gè)問題的最佳途徑之一[6-7]。細(xì)胞壁在結(jié)核分枝桿菌生存和增殖過程中起著至關(guān)重要的作用,二磷酸尿苷-半乳糖變異酶(uridine diphosphate galactopyranose mutase,UGM)是結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁生物合成的關(guān)鍵酶之一,是已確證的抗結(jié)核藥物新的理想靶標(biāo)[8-11]。UGM是國際上公認(rèn)的抗結(jié)核的重要靶標(biāo),除了參與結(jié)核分枝桿菌的繁殖,還參與多種真核和原核生物的生命代謝,包括多種寄生蟲、錐蟲及真菌等[12-13],并且是某些寄生蟲、真菌的重要毒力因子[14-15]。因此,UGM是一個(gè)非常有潛力的全新藥物靶標(biāo)。但是當(dāng)前UGM的分子反應(yīng)機(jī)理尚未闡釋清楚,且針對(duì)該酶的藥物研發(fā)嚴(yán)重滯后。基于此,貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室潘衛(wèi)東研究員項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)另辟蹊徑,探討了天然藥物分子與UGM的關(guān)系,構(gòu)建了結(jié)構(gòu)多樣化的抗結(jié)核天然小分子化合物庫,也報(bào)道了對(duì)天然來源UGM酶抑制劑的探索,并在后續(xù)研究過程中提出將動(dòng)態(tài)組合化學(xué)方法應(yīng)用于UGM抑制劑的篩選,實(shí)現(xiàn)了UGM抑制活性先導(dǎo)化合物的快速發(fā)現(xiàn)。

1 UGM分子探針的高效合成及其在探明UGM反應(yīng)機(jī)理上的應(yīng)用

因UGM天然底物及其類似物的合成難度非常大、穩(wěn)定性差且難以分離純化,不僅給UGM的分子作用機(jī)理及酶動(dòng)力學(xué)研究帶來困難,還嚴(yán)重制約了基于該酶靶標(biāo)的抗結(jié)核新藥研發(fā)進(jìn)程。當(dāng)前針對(duì)UGM的反應(yīng)機(jī)理有2種主流猜想(圖1A):一是通過打開異頭碳處的吡喃環(huán)C-O鍵并經(jīng)1,4脫水后形成過渡態(tài)中間體—1,4-環(huán)氧吡喃半乳糖,進(jìn)而完成整個(gè)催化過程;二是通過形成黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)-亞胺離子中間體完成轉(zhuǎn)化。為驗(yàn)證以上2種猜想,本研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)推測(cè)的反應(yīng)機(jī)理,設(shè)計(jì)并高效合成了一系列UGM天然底物—二磷酸尿苷-半乳呋喃糖(uridinediphosphate-galactofuranose,UDP-Galf)的類似物(圖1B),同時(shí)進(jìn)行了UGM抑制活性測(cè)試,深入探究了UGM的分子作用機(jī)理。其中化合物1(圖1B)是本項(xiàng)目基于吡喃糖轉(zhuǎn)化成呋喃糖過程中產(chǎn)生的高能量態(tài)中間體的可能結(jié)構(gòu)合成的底物類似物[16],但是該化合物由于尿苷片段的缺失導(dǎo)致其抑制活性較弱,間接證明尿苷片段對(duì)于UGM抑制活性的重要性;后續(xù)合成的帶有親電性環(huán)氧乙烷片段的化合物2表現(xiàn)出與UGM較好的親和力[17],進(jìn)一步證實(shí)UGM催化過程中可能會(huì)形成半乳糖醇的推測(cè),從而說明第2種猜想更為科學(xué)合理;此外,化合物3是本項(xiàng)目基于UGM催化過程中形成氧碳鎓離子的推測(cè),設(shè)計(jì)、合成的含有2個(gè)吸電子基團(tuán)的底物類似物[18]。以上分子探針的合成與相關(guān)活性研究,系統(tǒng)揭示了UGM的分子作用機(jī)理,為UGM分子機(jī)制、相關(guān)酶靶標(biāo)模型構(gòu)建及新型抑制劑開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

注:A為UGM參與半乳呋喃聚糖生物合成的2條可能途徑,B為本團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成的部分UGM探針分子。圖1 UGM反應(yīng)機(jī)理及探針分子Fig.1 The mechanism of UGM and their probes

2 基于貴州民族特色藥用植物的抗結(jié)核分枝桿菌天然小分子化合物庫的構(gòu)建

潘衛(wèi)東研究員項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)先后完成了20余種貴州民族藥用植物的系統(tǒng)分離純化,從中獲得了500余個(gè)天然產(chǎn)物,包括4個(gè)全新骨架和一系列新化合物。其中從唇形科(Labiatae)夏枯草屬(Prunella)植物夏枯草(PrunellavulgarisLinn)的醇提物中分離得到化合物35個(gè),包括4個(gè)新骨架化合物(Vulgarisins A～D,圖2)和1個(gè)新化合物。Vulgarisins A～D是本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)的具有5/6/4/5四環(huán)母核結(jié)構(gòu)的新骨架化合物[19-20],鑒于其特殊結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,目前尚未見全合成的相關(guān)報(bào)道,進(jìn)一步根據(jù)該類骨架結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜裂解規(guī)律,從夏枯草石油醚部位獲得了10個(gè)新骨架二萜化合物[21-22]。

圖2 夏枯草中分離得到的新骨架二萜化合物Fig.2 Diterpenoids with novel skeleton from Prunella vulgaris

此外,還從夏枯草醇提物的乙酸乙酯部位獲得了一個(gè)新穎的C21甾體洋地黃毒糖苷類化合物[23]。通過對(duì)菊科(Asteraceae)艾納香屬(Blumea)植物艾納香(Blumeabalsamifera)醇提物的系統(tǒng)分離純化,從其石油醚、乙酸乙酯等部位共獲得單體化合物34個(gè),包括15黃酮化合物和1個(gè)新化合物。除此之外,還從水龍骨科(Polypodiaceae)伏石蕨屬(Lemmaphyllum)植物抱石蓮[Lepidogrammitisdrymoglossoide(Bak.) Ching]、防己科(Menispermaceae)千金藤屬(Stephania)植物黃葉地不容(Stephaniaviridiflavens)及百合科(Liliaceae)粉條兒菜屬(Aletris)植物肺筋草[Aletrisspicata(Thunb). Franch.]等多種貴州特色民族藥用植物的醇提物中獲得了一系列天然產(chǎn)物或新化合物[24-25],為進(jìn)一步開展基于UGM的活性測(cè)試及體外抗菌活性評(píng)價(jià)提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)衍生物的活性篩選

針對(duì)當(dāng)前已報(bào)道的UGM抑制劑活性不高、成藥潛質(zhì)不足的問題,通過對(duì)前述天然小分子化合物庫中的天然產(chǎn)物進(jìn)行基于結(jié)核分枝桿菌UGM的抑制活性高通量篩選,發(fā)現(xiàn)來源于艾納香的黃酮化合物槲皮素及木犀草素均顯示出較好的UGM抑制活性[26]。進(jìn)一步的細(xì)菌水平活性篩選結(jié)果顯示,木犀草素具有較好的體外抗結(jié)核分枝桿菌活性,但其在抗結(jié)核分枝桿菌特異性上仍有明顯的不足[26]。同時(shí),分子對(duì)接結(jié)果也表明,其活性位點(diǎn)不在UGM的催化位點(diǎn)上,進(jìn)一步通過酶動(dòng)力學(xué)研究顯示木犀草素可與UGM的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合(圖3A和3B)[26]。Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖得到一組相交于X軸的直線(圖3C),屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,證實(shí)了UGM存在第2個(gè)藥物結(jié)合位點(diǎn),為UGM的分子機(jī)制研究及相關(guān)藥物開發(fā)開辟了新方向。為獲得具有特異性的UGM抑制劑,本項(xiàng)目進(jìn)一步通過對(duì)槲皮素及其類似物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化研究,完成了一系列黃酮類化合物的衍生合成,并對(duì)其進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系研究(圖4)[27],為下一步的高活性新衍生物設(shè)計(jì)與合成奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

圖3 木犀草素與UGM分子對(duì)接結(jié)果及雙倒數(shù)圖Fig.3 Docking pose predicted for luteolin and Lineweaver-Burk plot

圖4 黃酮類化合物UGM抑制活性的構(gòu)效關(guān)系 Fig.4 The structure-effective relationship of flavone compounds inhibited UGM

此外,還發(fā)現(xiàn)來源于夏枯草的天然小分子化合物—迷迭香酸,雖然對(duì)結(jié)核分枝桿菌UGM只有中等水平的抑制活性[解離常數(shù)(dissociation constant,Kd)為500 μmol/L],但其對(duì)肺炎克雷伯氏菌UGM的抑制活性優(yōu)異[平均Kd為(68.7±1.6)μmol/L],而且對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)也可達(dá)到50 mg/L,顯示出作為抗結(jié)核分枝桿菌新藥先導(dǎo)化合物的潛力[28]。為提升該先導(dǎo)化合物與UGM的結(jié)合能力及其成藥性,本團(tuán)隊(duì)采用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等方法,通過酯化、分子縮合、水解以及還原等方法[29],對(duì)迷迭香酸類天然先導(dǎo)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造,獲得64個(gè)具有酰胺類、磺酰胺類以及酯類等母核骨架的結(jié)構(gòu)衍生物(圖5)。進(jìn)一步的抗結(jié)核活性篩選結(jié)果顯示,11個(gè)結(jié)構(gòu)衍生物在終濃度為1 mmol/L時(shí)對(duì)MtUGM的抑制率均為40%以上,其中,活性最好的化合物4抑制率達(dá)81.54%,其Kd值為63 μmol/L左右(圖6),表現(xiàn)出與陽性對(duì)照UDP(抑制率為86.4%)相當(dāng)?shù)腢GM抑制活性[29]。與此同時(shí),該研究團(tuán)隊(duì)通過生物電子等排策略設(shè)計(jì)的烯酰胺類化合物抑制UGM活性比第一代化合物提高了近10倍[30]。總之,通過該方向的研究,擴(kuò)充了UGM抑制劑的結(jié)構(gòu)類型,也為后續(xù)新藥候選分子的發(fā)現(xiàn)提供較好的科學(xué)基礎(chǔ)。

圖5 迷迭香酸結(jié)構(gòu)衍生物的設(shè)計(jì)合成Fig.5 Design and synthesis of rosmarinic acid derivatives

圖6 通過動(dòng)態(tài)組合化學(xué)發(fā)現(xiàn)的全新UGM酶抑制劑Fig.6 Novel UGM enzyme inhibitors discovered by dynamic combinatorial chemistry method

4 基于動(dòng)態(tài)組合化學(xué)方法的UGM抑制劑快速發(fā)現(xiàn)策略

動(dòng)態(tài)組合化學(xué)作為一種非經(jīng)典的化學(xué)合成方法,系由諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主—法國科學(xué)家Jean-Marie Lehn于上世紀(jì)末提出,并逐漸應(yīng)用于藥物化學(xué)、材料學(xué)等領(lǐng)域[31-33]。本團(tuán)隊(duì)將動(dòng)態(tài)組合化學(xué)方法引入U(xiǎn)GM抑制劑的設(shè)計(jì)與合成中,并發(fā)現(xiàn)了一類具有全新結(jié)構(gòu)類型的UGM抑制劑(圖6,H3+A1化合物),針對(duì)MtUGM的抑制活性比先導(dǎo)化合物4和5提高了近300倍,這也是目前報(bào)道活性最好的UGM酶抑制劑,文章在Chem.Commum.一經(jīng)發(fā)表就被遴選為該期封面文章[34]。該法有效地建立了化學(xué)合成和生物評(píng)價(jià)之間的聯(lián)系,極大縮短了抗結(jié)核分子桿菌新藥苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)時(shí)間;本項(xiàng)目的相關(guān)研究結(jié)果也拓寬了動(dòng)態(tài)組合化學(xué)的應(yīng)用范圍,并為基于其他藥物靶標(biāo)抑制劑的快速發(fā)現(xiàn)提供了借鑒。

綜上,本研究團(tuán)隊(duì)在抗結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁生物合成關(guān)鍵酶UGM的分子作用機(jī)理、天然抑制劑發(fā)現(xiàn)及其衍生物設(shè)計(jì)合成等研究領(lǐng)域取得了一系列原創(chuàng)性、標(biāo)志性成果,探明了UGM反應(yīng)機(jī)理,構(gòu)建了貴州民族特色藥用植物的抗結(jié)核分枝桿菌天然小分子化合物庫,并發(fā)現(xiàn)了天然產(chǎn)物來源的UGM抑制劑,從而解決了UGM研究領(lǐng)域的一些關(guān)鍵科學(xué)問題,如UGM抑制劑成藥性不佳的瓶頸、UGM變構(gòu)位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)等等;“基于UGM新靶標(biāo)的抗結(jié)核分枝桿菌天然化合物及其類似物研究”項(xiàng)目榮獲2020年度貴州省自然科學(xué)獎(jiǎng)二等獎(jiǎng);項(xiàng)目的實(shí)施為貴州省培養(yǎng)了一批具有較高水平的抗結(jié)核分枝桿菌新藥研發(fā)的基礎(chǔ)研究專業(yè)人才,建立了較為系統(tǒng)的研究體系,可為研究與開發(fā)基于新靶標(biāo)的抗結(jié)核分枝桿菌藥物提供了技術(shù)支持,促進(jìn)了貴州省在中藥民族藥物創(chuàng)新研究領(lǐng)域的跨越式發(fā)展。