泌淋清膠囊對不同白血病細胞株增殖及凋亡的影響*

秦川霞, 黎中恒, 黃磊, 饒青, 宋晶睿, 黃裕兵, 李艷梅***

(1.省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室 & 貴州醫科大學 基礎醫學院 免疫教研室, 貴州 貴陽 550000; 2.貴陽市公共衛生救治中心 感染二科, 貴州 貴陽 550001)

白血病是一類造血干祖細胞的惡性克隆性疾病,因白血病細胞自我更新增強、增殖失控、分化障礙及凋亡受阻,而停滯在細胞發育的不同階段,在骨髓和其他造血組織中白血病細胞大量增生累積,使正常造血受抑制并浸潤其他器官和組織[1-2]。據2020年全球癌癥統計報告,世界上每年至少有31萬人因白血病死亡[3]。在惡性腫瘤所致的死亡率中,我國白血病居第9位,每年約6萬余人因白血病而死亡,在兒童及35歲以下成人中居第1位[3-4]。目前白血病的治療方法包括化療、靶向治療、免疫治療及異基因造血干細胞移植等,但是治療結果不容樂觀,耐藥、復發率高、副作用多、尋找供者難及費用高等,迫切需要更有效、毒副作用小及藥物來源不受限的治療藥物[1]。近年來,中藥被有效地用于治療實體腫瘤,植物很可能是抗癌藥物的來源之一[5],越來越多的研究證明了中藥對癌癥患者的療效[6]。貴州是中藥資源大省,現有中藥材品種資源4 802種,占全國中藥材種類總數的40%,居全國第2位[7]。據文獻調研表明,國內外僅有少量的文獻報道貴州民族藥抗白血病活性的研究[8-9]。本研究旨在貴州民族藥中尋找來源廣泛、毒副作用小的抗白血病的天然藥物。泌淋清膠囊(milinqing capsule,MLQ)是一種貴州民族藥,中醫認為其清熱解毒、利尿通淋,用于濕熱蘊結所致的小便不利,淋漓澀痛,尿血,急性非特異性尿路感染,前列腺炎見上述證候者[10]。MLQ主要成份包括四季紅、黃柏、酢漿草、仙鶴草、白茅根及車前草6味中藥材,其中黃柏、車前草為貴州地道藥材[11]。黃連素(berberine,Ber)屬于異喹啉類生物堿,可從黃連和黃柏中提取,用于治療癌癥、消化、代謝、心血管及神經系統疾病[12-17];車前草有降血脂、肝損傷保護、抗氧化、抗炎、降尿酸及造血等作用[18-22],但該藥功能主治中無治療白血病范疇,因此,本研究通過3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]法、流式細胞儀測定MLQ對不同白血病細胞株增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 人紅白血病細胞HEL、人慢性髓系白血病細胞K562及人急性淋巴細胞白血病細胞株Jurkat均來自貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室液氮凍存。

1.1.2主要藥物及試劑 MLQ(醫聯健康平臺),RPMI 1640培養基(美國Hycone),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;浙江天杭生物),MTT、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO;北京索萊寶),細胞凋亡試劑盒(美國BD)。

1.1.3主要儀器 多功能酶標儀(美國Gene),流式細胞分析儀(美國艾森),A2型生物安全柜、離心機、細胞培養箱、超低溫冰箱(美國Thermo),倒置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss),電子天平(美國METTLER TOLEDO),立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 從液氮罐取出HEL、K562及Jurkat細胞復蘇,用含5%胎牛血清的RPMI-1640培養液,5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養至對數增長期。

1.2.2MLQ樣品的制備 按需稱取適量MLQ藥物(去除膠囊殼),按料液比1 g∶20 mL溶于60%乙醇溶液(另40%為ddH2O)中,充分混勻,搖床搖1 h,超聲40 min,脫脂棉過濾2次;旋蒸儀旋蒸去除乙醇,-80 ℃過夜;凍干機去除水分,得粉末狀樣品;稱量所得粉末狀樣品,將其配成100 g/L的MLQ母液(溶劑為10%DMSO溶液,另90%為ddH2O)備用。

1.2.3配制MTT溶液 稱取MTT粉末0.5 g,加滅菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS )100 mL,配成5 g/L的MTT溶液,60 ℃溶解,0.22 μm過濾膜過濾除菌,分裝,-20 ℃保存,4 ℃備用。

1.2.4配制三聯液 稱取十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)10 g,加少于95 mL的ddH2O使其充分溶解,加異丙醇5 mL后定容至100 mL,加鹽酸100 μL。

1.2.5HEL細胞的MTT法測定 取對數增長期的HEL細胞(接種密度為8×103個/孔)接種于96孔板中,每孔 RPMI-1640培養基(含5% FBS)90 μL,培養4 h,每孔加不同濃度的MLQ 10 μL,使其終濃度分別為125、250及500 mg/L,每個濃度設4個復孔(記為實驗組)和1個實驗空白孔(實驗空白孔僅有培養基和對應濃度的藥物,未接種HEL細胞);另設對照組(加10%DMSO溶液10 μL),對照組設置4個復孔和1個對照空白孔(對照空白孔僅有培養基和10%DMSO溶液10 μL,未接種HEL細胞)。細胞置于37 ℃培養箱內開始計時,培養48 h;每孔加MTT溶液10 μL,培養4 h;每孔加三聯液100 μL,37 ℃培養箱過夜;酶標儀測570 nm波長各孔的吸光度(absorbance,OD),計算存活率。

1.2.6K562 細胞的MTT法 取對數生長期的K562細胞(接種密度為8×103個/孔)接種于96孔板中,每孔 RPMI-1640培養基(含5% FBS)90 μL,培養4 h,每孔加不同濃度的MLQ 10 μL,使其終濃度分別為62.5、125.0、250.0 及500.0 mg/L,每個濃度設4個復孔(記為實驗組)和1個實驗空白孔(實驗空白孔僅有培養基和對應濃度的藥物,未接種K562細胞);另設對照組(加10%DMSO溶液10 μL),對照組設置4個復孔和1個對照空白孔(對照空白孔僅有培養基和10%DMSO溶液10 μL,未接種K562細胞)。細胞置于37 ℃培養箱,培養48 h;每孔加MTT溶液10 μL,培養4 h,每孔加三聯液(SDS 10 g、異丙醇5 mL及鹽酸100 μL,加ddH2O至終體積為100 mL)100 μL,37 ℃培養箱過夜;酶標儀測570 nm波長各孔的OD,計算存活率。

1.2.7Jurkat細胞的MTT法 取對數生長期的人白血病細胞Jurkat(接種密度為1×104個/孔)接種于4個96孔板中,每個96孔板進行如下處理:每孔加RPMI-1640培養基(含5% FBS)90 μL,培養4 h;加不同濃度MLQ 10 μL,使其終濃度分別為62.5、125.0及250.0 mg/L,每個濃度設4個復孔(記為實驗組)和1個實驗空白孔(實驗空白孔僅有培養基和對應濃度的藥物,未接種Jurkat細胞);另設對照組(加10%DMSO溶液10 μL),對照組設置4個復孔和1個對照空白孔(對照空白孔僅有培養基和10%DMSO溶液10 μL,未接種Jurkat細胞)。細胞置于37 ℃培養箱,4個96孔板分別培養24、48、72及96 h,于不同時間點的96孔板內每孔加 MTT溶液10 μL,培養4 h,每孔加三聯液(SDS 10 g、異丙醇5 mL及鹽酸100 μL混合,加ddH2O至終體積為100 mL)100 μL,37 ℃培養箱過夜;酶標儀測570 nm波長各孔的OD,計算存活率。

1.2.8流式細胞儀測定 取對數生長期的人白血病細胞Jurkat以5×105個/皿的接種密度接種于60 mm的圓形培養皿,每個培養皿加RPMI-1640培養基(含5% FBS)2 000 μL ,細胞培養箱中培養4 h,加不同濃度的MLQ,終濃度分別為150、300及600 mg/L;對照組加與600 mg/L濃度等量的溶劑(10%DMSO溶液),于5% CO2的37 ℃培養箱中培養,分別收集24 h和48 h的細胞,用碘化丙啶(propidium iodide,PI)、Annexin V-FITC染色15 min,于流式細胞儀上測細胞凋亡并計算細胞凋亡率。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 HEL細胞存活率

由圖1可見,125、250及500 mg/L MLQ作用于人紅白血病細胞HEL 48 h,隨著MLQ濃度的增加,HEL細胞存活率越低;與對照組相比,250 mg/L 及500 mg/L MLQ組人紅白血病細胞HEL存活率均明顯降低,差異有高度統計學意義(P<0.000 1)。

注:(1)與對照組比較,P<0.0001。圖1 各濃度MLQ組人紅白血病細胞HEL的存活率Fig.1 Survival rate of human erythroleukemia cell HEL at each concentration in MLQ group

2.2 K562細胞存活率

由圖2可見,62.5、125.0、250.0及500.0 mg/L MLQ作用于人慢性髓系白血病細胞K562細胞48 h,隨著MLQ濃度的增加,K562細胞的存活率越低;與對照組相比,125.0 mg/L、250.0 mg/L及500.0 mg/L MLQ組K562細胞存活率均明顯降低,差異具有高度統計學意義(P<0.000 1)。

注:(1)與對照組比較,P<0.000 1。圖2 各濃度MLQ組人慢性髓系白血病細胞K562的存活率Fig.2 Survival rate of human chronic myeloid leukemia cell K562 at each concentration in MLQ group

2.3 Jurkat細胞存活率

由圖3可見,62.5、125.0及250.0 mg/L MLQ作用于人急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞48 h,隨著MLQ濃度的增加,Jurkat細胞的存活率越低;與對照組相比,62.5 mg/L MLQ組Jurkat細胞存活率降低,差異具有統計學意義(P<0.005);125.0 mg/L及250.0 mg/L MLQ組Jurkat細胞存活率均明顯降低,差異具有高度統計學意義(P<0.000 1)。

注:與對照組比較,(1)P<0.005,(2)P<0.000 1。圖3 各濃度MLQ組人急性淋巴細胞性白血病細胞Jurkat的存活率Fig.3 Survival rate of human acute lymphocytic leukemia cell Jurkat at each concentration in MLQ group

2.4 流式細胞術檢測Jurkat細胞凋亡率

由圖4可見,150、300及600 mg/L MLQ 作用于人急性淋巴細胞性白血病細胞Jurkat 24 h,隨著MLQ濃度的增加,Jurkat細胞的凋亡率越高;與對照組相比,300 mg/L及600 mg/L MLQ組Jurkat細胞凋亡率均明顯增高,差異有高度統計學意義(P<0.000 1);150、300及600 mg/L MLQ 作用于人急性淋巴細胞性白血病細胞Jurkat 48 h,隨著MLQ濃度的增加,Jurkat細胞的凋亡率越高;與對照組相比,300 mg/L及600 mg/L MLQ組Jurkat細胞凋亡率均明顯增高,差異有高度統計學意義(P<0.000 1),且與對照組相比,48 h比24 h的差異更明顯。

注:A為凋亡率流式圖(MLQ 作用于Jurkat細胞 24 h和48 h),B為凋亡率線圖;(1)與同時間點對照組比較,P<0.000 1。圖4 各濃度MLQ組Jurkat細胞24 h和48 h的細胞凋亡Fig.4 Jurkat cell apoptosis for 24 h and 48 h in MLQ groups

3 討論

白血病臨床表現與正常造血細胞生存受抑和白血病細胞增殖浸潤有關;正常造血細胞生成受抑可引起感染、發熱、出血和貧血;白血病細胞增殖浸潤可導致肝、脾、淋巴結腫大及其他器官病變;癥狀的緩急主要取決于白血病細胞在體內的增長速率和積蓄程度[23]。白血病細胞通過對細胞凋亡的抵抗保持無限增殖,這些細胞可積聚在外周血、骨髓和淋巴器官中[24]。目前白血病的治療結果并不容樂觀。隨著醫藥學的發展,天然藥物在抑制腫瘤生長、增加化療藥物療效或減輕化療藥物毒副反應方面的優勢越來越受到研究者的重視[25-27]。中藥(復方)由多個單方、多種化學成分組成,具有多成分、多效應、多靶點及多途徑的特征[28]。隨著中草藥研究的發展,大量研究表明,中草藥與化療藥物聯合應用,可提高化療藥物的療效[29-30]。中藥的現代化研究是科學發展的必然過程。貴州省有中草藥資源4 802種,其中藥用植物4 419種,被列入國家重點保護的藥用植物有28種,占全國58種的48.3%。貴州省中藥材資源豐富、氣候適宜、生態優良、民族醫藥積累豐富[7]。貴州民族藥用于腫瘤輔助治療已廣泛應用于臨床,且臨床效果已得到充分肯定[31]。所以,本研究旨在從貴州民族藥中尋找一種能抗白血病的天然藥物。

本研究首先對民族藥進行了醇提旋蒸凍干的處理,通過MTT法對3種不同類型的白血病細胞模型進行了細胞增殖的研究,結果表明MLQ對人紅白血病細胞HEL、人慢性髓系白血病細胞K562以及人急性淋巴細胞白血病細胞Jurkat的生長繁殖有顯著的抑制作用,且隨著MLQ濃度的增加,3種細胞的存活率均明顯下降;MTT結果顯示,與對照組相比,MLQ分別作用于3種細胞48 h,62.5 mg/L、125.0 mg/L MLQ組Jurkat細胞及125.0 mg/L MLQ組K562 細胞的增殖均受到明顯的抑制(P<0.001);HEL、K562、Jurkat細胞代表了白血病的3種不同分型,MLQ在體外對這3種白血病細胞均有顯著的抑制增殖的作用;由流式細胞術結果可以看出,無論是24 h還是48 h,與對照組相比,300及600 mg/L MLQ組Jurkat細胞發生凋亡,48 h差異更明顯(P<0.001)。MLQ是已上市的貴州民族藥,可直接應用于人體,且原材料豐富、來源不受限,因此具有很好的臨床應用前景;本研究探討了MLQ的新用途和新功效,其很可能成為抗白血病的新藥,或從其中分離出能高效增敏的化合物。但是,目前對于MLQ抗白血病的機制還不夠明確,本研究團隊將對其作用機制進行系統、深入的探究。

綜上所述,貴州民族藥MLQ可以有效抑制不同類型白血病細胞的增殖并促進凋亡,尤其是對人紅白血病細胞HEL、人慢性髓系白血病細胞K562以及人急性淋巴細胞白血病細胞Jurkat,具有制備白血病細胞增殖抑制劑或防治白血病藥物的潛在價值。