2型糖尿病大鼠血清中蛋白結合態銅和鋅水平的測定*

秦旭, 李軍, 胡勇, 于春, 黃磊, 婁波, 羅茹丹, 徐緯

(貴州醫科大學 公共衛生與健康學院 環境污染與疾病監控教育部重點實驗室, 貴州 貴陽 550025)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種代謝異常所導致的高血糖病,DM的發病以2型DM(type 2 DM,T2DM)為主,1型DM(T1DM)和其它類型DM少見[1-2]。研究表明,銅(copper,Cu)、鋅(zinc,Zn)等微量元素與T2DM關系密切,其增加或缺失都會使胰島素的合成和釋放受到影響[3-4]。既往研究中,學者們主要關注血清中微量元素總量與T2DM的關系,很少關注元素的形態[5-6]。微量元素在血清中的存在形態為蛋白結合態和非蛋白結合態,與蛋白質結合而存在的元素形態為蛋白結合態元素,其它存在形態的元素均為非蛋白結合態元素[7]。與非蛋白結合態元素相比,元素蛋白結合態在機體內發揮的生物學作用更穩定[7]。因此,相較于測定元素總形態含量而言,檢測血清中蛋白結合態元素含量更能準確反映元素在T2DM發生發展過程中的作用,對T2DM的輔助診斷和治療具有更重要的價值。蛋白結合態元素與T2DM的關系的研究比較缺乏,因此,本研究以T2DM大鼠為研究對象,采用連續光源石墨爐原子吸收光譜法(atomic absorption spectroscopy,AAS)檢測T2DM大鼠血清中Cu、Zn蛋白結合態含量,初步探討Cu、Zn元素的蛋白結合態在T2DM大鼠元素含量分析中的價值,可供臨床T2DM的診療和基礎研究時參考使用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 清潔級成年Sprague Dawley(SD)健康大鼠30只,雌雄各半,體質量180～220 g,由學校實驗動物中心提供[SYXK(黔)2018-0001]。

1.1.2主要儀器與試劑 連續光源火焰-石墨爐原子吸收光譜儀(德國耶拿conntraa700),離心機(上海盧湘儀TGL-16.5M),電子天平(梅特勒HZT-B2000),血糖儀(珠海柯諾S286);Cu、Zn單元素標準儲備溶液1 000 mg/L(國家有色金屬中心),硝酸(優級純,重慶川東化工),無水乙醇(優級純,天津市鑫宇精細化工),鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ;上海皓鴻),檸檬酸和檸檬酸三鈉(上海MACKUN)。

1.2 檢測方法

1.2.1造模及分組 參考文獻[8]建立T2DM大鼠模型。采用隨機數字表法將大鼠隨機分為對照組(雌雄各5只,普通飼料喂養)和T2DM模型組(雌雄各10只,高糖高脂飼料喂養),喂養4周;對照組大鼠腹腔注射檸檬酸緩沖液,T2DM模型組腹腔注射35 mg/kg的STZ且誘導5 d;空腹采集2組大鼠尾靜脈血液檢測空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),取3次平行FBG檢測的均值,以FBG≥11.1 mmol/L作為成模標準。

1.2.2取樣 取“1.2.1”項下2組大鼠心臟血,靜置30 min,于4 ℃下12 000 r/min離心10 min取血清,分別放入1.5 mL離心管內,儲存于-80 ℃超低溫冰箱內待檢。

1.2.3樣品檢測 取“1.2.1”項下2組大鼠血清100 μL加入離心管中,加硝酸17 μL,混勻靜置10 min,蒸餾水稀釋至1 mL,充分混勻,采用連續光源石墨爐原子吸收光譜法測定Cu、Zn含量;再取2組大鼠血清100 μL加入1.5 mL離心管內,分別加70%(V/V,下同)的乙醇400 μL混勻,靜止5 min,4 ℃下12 000 r/min離心10 min,上清液用0.45 μm一次性水系過濾器過濾,取濾液300 μL,加1%硝酸700 μL,充分混勻,采用連續光源石墨爐原子吸收光譜法測定Cu、Zn含量;Cu、Zn元素總形態含量與非蛋白結合態含量之差即為蛋白結合態含量。

1.2.4標準儲備溶液的配置 取1 000 mg/L的Cu、Zn標準儲備液各1 mL,1%硝酸稀釋,定容到100 mL容量瓶中,搖勻,配成10 mg/L的標準儲備液;取10 mg/L的Cu、Zn標準儲備液各3 mL,定容到100 mL的容量瓶中,搖勻,配成300 μg/L的標準儲備液。

1.2.5標準曲線 用1%的硝酸作為稀釋液,儀器自動將“1.2.4”項下300 μg/L的Cu、Zn標準儲備液稀釋為0、20、60、140、220及300 μg/L的單元素標準質量濃度溶液系列。

1.2.6檢出限和定量限 按“1.2.3”項下的實驗方法制備空白溶液,根據儀器工作條件連續測量11次,分別以測定值的3倍和10倍標準偏差值(S)除以標準曲線的斜率(k)得到各元素含量的檢出限(3 s/k)和定量限(10 s/k)。

1.2.7精密度實驗 按“1.2.3”項下的方法分別制備6份對照組大鼠血清Cu、Zn元素總形態和非蛋白結合態元素血清樣品,根據儀器工作條件進行測定,計算Cu、Zn總含量、非蛋白結合態含量及相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.8回收實驗 取“1.2.2”項下對照組大鼠血清制備均質血清50 μL和100 μL各12份,各自均分為4組;取50 μL和100 μL的血清各1組,按“1.2.3”項下的實驗方法分別處理為對照組大鼠血清Cu、Zn元素總形態樣品和非蛋白結合態樣品,采用連續光源石墨爐原子吸收光譜法測定血清本底值,測定值分別取均數即為總形態樣品和非蛋白結合態樣品本底值;另取血清50 μL分為3組,按加標量為本底值比加標值低(1∶0.5)、中(1∶1.0)及高(1∶1.5)的3個比例進行加標,后續步驟按“1.2.3”項下的實驗方法進行,采用連續光源石墨爐原子吸收光譜法測定3組血清Cu、Zn元素含量;取剩余100 μL血清3組,加標量同上,后續步驟按“1.2.3”項下實驗方法進行,采用連續光源石墨爐原子吸收光譜法測定加標后3組血清Cu、Zn元素含量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 標準曲線、檢出限和定量限

把Cu、Zn的質量濃度作為橫坐標、吸光度作為縱坐標、繪制標準曲線,結果表明,標準曲線的相關系數均在0.999以上,Cu、Zn標的質量濃度均在0～300 μg /L內與對應的吸光度呈線性關系,Cu、Zn元素線性關系良好,該標準曲線對待測元素可以準確定量。見表1。

表1 Cu、Zn元素線性參數、檢出限和定量限Tab.1 Linear parameters, limits of detection, and quantification of Cu and Zn elements

2.2 精密度和回收率

采用連續光源石墨爐原子吸收光譜法測定對照組大鼠血清Cu、Zn元素總形態樣品含量和非蛋白結合態含量,對對照組大鼠血清Cu、Zn元素總形態樣品含量和非蛋白結合態含量進行精密度和加標回收率實驗,并計算測定值的RSD和加標回收率,結果表明,Cu、Zn元素總形態含量和非蛋白結合態含量RSD測量值均小于5%;Cu、Zn元素總形態和非蛋白結合態低、中、高加標回收率的范圍為87%～110%,能滿足加標回收率范圍80%～120%的要求。見表2。

表2 Cu、Zn元素總形態含量和非蛋白結合態精密度和回收率實驗結果Tab.2 Experimental result of total morphological content of Cu and Zn elements as well as precision and percent recovery of non-protein bound states

2.3 血清中不同形態Cu、Zn元素的含量

結果顯示,與對照組相比,T2DM模型組大鼠血清Cu總形態含量和蛋白結合態含量均升高(P<0.05),但非蛋白結合態含量無變化(P>0.05);與對照組相比,T2DM模型組大鼠Zn總形態含量和蛋白結合態含量均降低(P<0.05),但非蛋白結合態含量變化無差異(P>0.05)。見表3。

表3 對照組和T2DM模型組大鼠血清中不同形態Cu、Zn的含量Tab.3 Amount of Cu and Zn in the serum of control and T2DM model rats

2.4 血清中不同形態Cu、Zn含量的比值

結果顯示,與對照組相比,T2DM模型組大鼠血清中Cu和Zn總形態含量和蛋白結合態含量比值均升高(P<0.05),但非蛋白結合態Cu和Zn含量比值變化無差異(P>0.05)。見表4。

表4 對照組和T2DM模型組大鼠血清不同形態Cu/Zn比值Tab.4 Ratio of serum Cu and Zn in different forms between control group and T2DM

2.5 血清中不同形態Cu、Zn含量的相關性

結果顯示,所有大鼠血清中Cu總形態含量和蛋白結合態含量與Zn總形態含量和蛋白結合態含量呈負相關關系(P<0.05),而非蛋白結合態Cu含量與非蛋白結合態Zn無相關性(P>0.05)。見表5。

3 討論

T2DM作為一種嚴重影響人群健康的慢性非傳染性疾病,一旦患病無法治愈[9-10]。隨著經濟的發展,人民生活水平的提高,生活方式改變以及人口老齡化,我國DM患病率快速增長,增長速度高于亞洲其它國家,給社會帶來沉重的負擔[11-12]。根據調查數據顯示,我國成人DM患病率已經達到12.8%,患者總人數也已經達到了1.298億[12-13]。Cu、Zn是人體不可或缺的必要營養物質,對胰島素的合成、分泌、貯存、活性以及能量代謝起著重要作用[14-15]。既往研究主要通過檢測血清中元素總形態含量來研究機體元素代謝水平,但由于血清中元素總形態含量易受到飲食、環境等因素的影響[4-5];此外,關于患者或T2DM大鼠血清中Cu、Zn總形態含量研究結果并不統一,存在一定程度的偏差[16-17],而元素的蛋白結合形態相對穩定,不易受到上述因素的影響。因此,分析T2DM血清中元素蛋白結合態含量對進一步探明元素與T2DM的關系具有重要的價值。

本研究以T2DM大鼠為對象,采用連續光源火焰-石墨爐原子吸收光譜儀檢測T2DM大鼠血清中Cu、Zn總形態含量和非蛋白結合態元素含量,從元素蛋白結合態的角度分析大鼠血清中Cu、Zn含量與T2DM發生和發展的關系,結果顯示,T2DM大鼠血清中Cu總形態含量升高,Zn總形態元素含量降低,Cu、Zn總形態元素含量比值升高,Cu總形態元素含量與Zn總形態元素含量呈負相關關系,提示T2DM大鼠血清中Cu、Zn元素出現紊亂。相關研究表明,銅在機體中參與了多種酶活性及生物代謝,主要以結合銅藍蛋白的形式影響生物代謝,鋅與2型糖尿病的關系非常密切,直接參與了人體內胰島素的合成、儲存及分泌[5];Zn元素分布在胰島β細胞顆粒中,能夠提高胰島素的穩定性,并調節胰島素降糖作用[18];Zn主要靠金屬硫蛋白緩沖體系保持動態平衡,當T2DM發生時,機體內腸道中Cu元素的吸收率提高、積蓄量增加,與Zn元素競爭同一載體蛋白-金屬硫蛋白并產生拮抗作,導致Zn元素含量減少,進而引起T2DM大鼠血清中Cu、Zn元素紊亂[19-20]。提示T2DM大鼠血清中Cu、Zn元素出現紊亂可能與蛋白結合態的元素有關。

進一步分析T2DM大鼠血清中Cu、Zn非蛋白結合態元素含量,發現T2DM大鼠血清中Cu、Zn元素含量無明顯變化,Cu、Zn非蛋白結合態元素含量比值亦無明顯變化,Cu非蛋白結合態元素含量與Zn非蛋白結合態元素含量也無明顯的相關性,提示T2DM大鼠血清中Cu、Zn非蛋白結合態含量未發生紊亂。相關研究表明,不同元素的化學形態生物效應差別很大,它們決定了元素在生物體內的化學行為,表現出不同的生物學效應,元素蛋白結合態相較于非蛋白結合態在體內比較穩定且發揮著重要的生物學作用,如有銅藍蛋白(抗氧化劑作用)、血藍蛋白(運輸氧)、超氧化物歧化酶(歧化反應)、血紅蛋白(運輸氧)等[21]。由此推測,在大鼠T2DM的發生過程中,非蛋白結合元素可能未發揮主要的生物效應,可能與大鼠T2DM的發生無直接的關聯。

結合元素總形態和非蛋白結合態元素含量的研究結果,分析元素蛋白結合態研究結果顯示,T2DM大鼠血清中Cu蛋白結合態含量升高,Zn蛋白結合態含量降低,Cu、Zn蛋白結合態元素含量比值升高,Cu蛋白結合態元素含量與Zn蛋白結合態元素含量呈現負相關關系,提示T2DM大鼠血清中蛋白結合態Cu、Zn元素發生紊亂,T2DM大鼠血清中總形態元素Cu、Zn的紊亂是由于蛋白結合態Cu、Zn元素的紊亂引起。相關研究顯示,Zn與2型糖尿病的關系非常密切,直接參與了人體內胰島素的合成、儲存及分泌[5];Zn在細胞中大部分與蛋白緊密結合,只有一小部分以游離形式存在,到目前為止,已發現300多種Zn活化的金屬蛋白酶和2 000多種Zn依賴性轉錄因子[22];人體內Zn穩態主要靠金屬硫蛋白/硫蛋白緩沖體系、Zn轉運蛋白和Zn-鐵轉運體蛋白家族兩大Zn轉運系統[19-20],金屬硫蛋白/硫蛋白緩沖體系重點參與Zn的跨膜轉運,而Zn轉運蛋白和Zn-鐵轉運體蛋白家族主要參與Zn的儲存及運輸[19];金屬硫蛋白是具有抗氧化特性的Zn結合蛋白,可以保護細胞和組織免受氧化應激,其表達可降低高血糖誘導的器官中的氧化應激、糖尿病并發癥風險[21]。另有研究表明,銅在機體內主要以結合銅藍蛋白的形成存在,與了多種酶活性及生物代謝,Cu與Zn在人體中相互拮抗,如果體內Cu元素增多,則會影響Zn元素的吸收使其大量丟失,促使糖尿病及其并發癥的發生和發展[3]。由此推測,在大鼠T2DM發生過程中,蛋白結合形態Cu、Zn元素在大鼠T2DM發生過程中發生了顯著變化。

綜上所述,T2DM大鼠血清中Cu、Zn總形態的變化主要是由蛋白結合態變化引起,與非蛋白結合態含量變化無直接關聯,蛋白結合形態Cu、Zn元素在大鼠T2DM發生過程中發揮了重要的生物學作用。以上研究結果提示,下一步研究工作應重點關注元素的蛋白結合態的含量變化,可忽略元素非蛋白結合態含量變化。