人結節型皮膚基底細胞癌病變組織和細胞株中視蛋白3的表達及功能*

許佳, 韓寧, 章俊, 蘭應華, 辜陽廣, 羅歡歡, 楊玉麟, 汪宇, 陸洪光***

(1.貴州醫科大學 臨床醫學院 皮膚病與性病學教研室, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州醫科大學附屬醫院 皮膚科, 貴州 貴陽 550004)

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞和組織 TE354T細胞系從ATCC細胞庫(貨號CRL-7762)購買;選取本院31例結節型基底細胞癌患者的癌組織及距病灶>2 cm的癌旁正常組織(paired adjacent normal skin tissues,PANST)標本分別為病灶組與PANST組,儲存于-80 ℃冰箱,研究已獲醫院臨床研究倫理委員會批準(2021-150)及患者知情同意。

1.1.2主要試劑與儀器 胎牛血清(fetal Bovine Serum,FBS;美國 ScienCell ),4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、抗熒光淬滅封片劑(上海碧云天),DMEM高糖培養基(DMEM high glucose,DMEM)、OPTI-MEM 減血清培養基(OPTI-MEM Reduced Serum Medium,OPTI-MEM;美國Gibco),引物(上海生工),0.1%結晶紫染色液、實時熒光定量 PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒、高效放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)組織/細胞裂解液(北京 Solarbio),Lipofectamine 2000(美國賽默飛),兔抗人OPN1抗體、兔抗人OPN2抗體、兔抗人OPN3抗體、兔抗人OPN4抗體、兔抗人OPN5抗體、環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)單克隆抗體、磷酸化CREB(p-CREB)單克隆抗體、鈣調蛋白依賴激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ ,CAMKⅡ)單克隆抗體、磷酸化CAMKⅡ(p-CAMKⅡ)單克隆抗體、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(中國MDL公司),Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測試劑盒(日本Dojindo),Transwell小室(美國Corning),Annexin V-FITC/ PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒(上海七海復泰);4%多聚甲醛(國藥集團化學試劑),流式細胞儀BD FACSLyricTM(美國BD FACSLyricTM),酶標儀和曝光儀ChemiDoc MP 成像系統(美國Bio-Tek),蛋白垂直電泳儀(美國BIO-RAD),RT-qPCR擴增儀(美國Life Technologies)。

1.2 實驗方法

1.2.1標本處理 將PANST組與病灶組患者標本分別置于研缽,加液氮,反復多次用研磨器將其研磨呈粉狀,收集于EP管中。

1.2.2組織免疫熒光 取“1.2.1”項下2組標本固定于4%甲醛,石蠟包埋,石蠟切片脫蠟至水,置于EDTA抗原修復液中微波修復抗原,血清封閉,加一抗(OPN3抗體)50 μL,覆蓋切片上的組織,4 ℃過夜,加相應種屬熒光二抗(山羊抗兔IgG H&L)50～100 μL于37 ℃孵育50 min,加DAPI染液室溫避光染色5 min,加抗熒光淬滅劑,蓋玻片封片,熒光顯微鏡下觀察,藍色為DAPI,綠色為OPN3。

1.2.3細胞培養 取人BCC細胞系TE354T于含10%FBS和1%雙抗的DMEM培養液,37 ℃的5%CO2培養箱培養;隔天換液,培養細胞數量增殖到培養瓶底部面積的70%,含0.01% EDTA-0.25%胰蛋白酶的胰酶消化液消化細胞,待細胞從壁上脫離,終止消化。

1.2.4RT-qPCR實驗 采用TRIzol試劑提取“1.2.1”項下2組標本和“1.2.3”項下TE354T細胞中的總RNA,再逆轉錄為互補DNA(complementary DNA,cDNA)。設置熔解曲線反應程序,采用熔解曲線分析引物特異性及與該反應體系的適宜條件,內參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),根據課題組前期研究設計OPNs引物序列[19],OPNs的表達水平按2-ΔΔCt值取對數值后進行分析;反應條件為95 ℃孵育10 min(變性),95 ℃孵育15 s(退火)、60 ℃孵育10 min(延伸)、退火與延伸重復40個循環。

1.2.5蛋白印跡法(Western blot)實驗 取“1.2.1”項下2組標本和“1.2.3”項下TE354T細胞置于冰上,組織細胞裂解液(radio immunoprecipitation assay,RIPA):苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)按99∶1的配比比例配置適量1 mmol/L RIPA裂解液進行蛋白裂解,利用聚丙烯酰氨凝膠電泳(dodecyl sulfate,sodium salt-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)將目標蛋白分離,再轉移至聚二偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,封閉液封閉2 h,兔抗人的一抗工作液4 ℃孵育過夜,鼠抗兔的二抗工作液室溫孵育45 min;化學發光試劑(electrochemiluminescence,ECL)下進行拍照、曝光。采用Image J測量條帶灰度值。

1.2.6靶向沉默細胞中的OPN3 待“1.2.3”項下細胞生長至培養板板底面積40%融合時備用。將細胞密度調至1×107個/L,分為對照(Control)組、空白(RNAi-NC)組及實驗(RNAi-OPN3)組,于6孔板中分別加Opti-MEM及DMEM培養基,采用Lipofectamine 2000使小干擾RNA轉染細胞,其中實驗組小干擾RNA濃度為60 nmol/L,繼續培養48 h,消化處理細胞。

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1.2.7CCK-8實驗 取“1.2.3”項下細胞以2×104個/孔的密度均勻地接種于96 孔培養板中,待細胞貼壁后,用siRNA-Lipofectamine 2000工作液轉染細胞,分別在0、24、48及72 h加CCK-8 試劑10 μL,放回細胞培養箱培養2 h,450 nm處檢測吸光度值;每組設置5個復孔,以保證實驗精確性。

1.2.8Transwell遷移實驗 取“1.2.6”項下細胞用無血清DMEM培養基1 mL重懸,使細胞濃度為2×108個/L,在24孔板內每孔加入400 μL含10% FBS 的DMEM培養基,將Transwell小室放入孔板內,消化處理細胞,無血清DMEM培養基1 mL重懸,使細胞濃度為2×108個/L,每個小室內加入200 μL細胞懸液,培養6 h以上,取出小室,棉簽擦拭上室細胞,4%多聚甲醛固定,0.1%結晶紫染色,拍照。

1.2.9細胞劃痕實驗 取“1.2.6”項下細胞以2×104/孔的密度均勻地接種在96 孔板上,加DMEM 培養基培養,待細胞長滿整個孔板時,10 μL槍頭垂直孔板劃線,吸棄培養基,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗劃下的細胞,放培養箱中培養;顯微鏡下拍照,分別檢測于劃痕后 0 、48及 72 h 觀察細胞的劃痕寬度。每組設置5個復孔以上。

1.2.10流式雙染法細胞凋亡檢測Annexin V FITC/PI 用流式離心管收集“1.2.6”項下轉染48 h細胞的上清液,利用0.25%的胰酶消化細胞,收集消化好的細胞加入上清液離心,PBS1 mL重懸細胞,再用1×Binding Buffer 400 μL重懸細胞,再加入 Annexim V-FITC 5 μL并用移液器吹勻,在室溫下避光孵育15 min,加PI染色液10 μL混勻,冰浴避光放置5 min,30 min內用流式細胞儀檢測。Annexin V-FITC 顯示的是綠色熒光,代表凋亡的細胞。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 組織中OPN3的表達

免疫熒光檢測結果顯示,OPN3在PANST組與病灶組中均有表達;Western blot和RT-qPCR結果顯示,與PANST組比較,病灶組BBC患者病灶組織中OPN3蛋白和mRNA表達增高(P<0.05)。見圖1。

注:A為免疫熒光檢測結果(400×),綠色為OPN3,藍色為DAPI;B、C分別為OPN3蛋白的檢測結果和定量結果;D為OPN3 mRNA表達量,(1)與PANST組比較,P<0.05。圖1 病灶組和PANST組組織中OPN3的表達Fig.1 Expression of OPN3 in human nodular BCC lesion group and PANST group

2.2 細胞中OPN3的表達

采用Western blot與RT-qPCR分別檢測人TE354T細胞系中OPN的蛋白與mRNA水平,結果表明,與OPN1、OPN2、OPN4及OPN5比較,TE354T細胞系中OPN3的蛋白和mRNA水平最高(P<0.05)。見圖2。

注:A、B分別為OPN蛋白的檢測結果和相對定量結果,C 為OPN mRNA相對表達量;(1)與OPN1比較,P<0.05;(2)與OPN2比較,P<0.05;(3)與OPN4比較,P<0.05;(4)與OPN5比較,P<0.05。圖2 人BCC細胞株TE354T中 OPN蛋白和mRNA的表達Fig.2 Expression of OPN protein and mRNA in human BCC cell line TE354T

2.3 下調OPN3后細胞中OPN3的表達

小干擾RNA沉默人TE354T細胞系中的OPN3后,Western blot和RT-qPCR實驗結果顯示,與Control組、RNAi-NC組比較,RNAi-OPN3組TE354T細胞中OPN3的蛋白和mRNA表達下降(P<0.05)。見圖3。

注:A、B分別為OPN3蛋白的表達和定量結果,C為OPN3 mRNA表達量;(1)與Control組比較,P<0.05,(2)與RNAi-NC組相比,P<0.05。圖3 下調OPN3后各組人BCC細胞株TE354T中 OPN3蛋白和mRNA的表達Fig.3 Expression of OPN3 protein and mRNA in human BCC cell line TE354T in each group after down-regulation of OPN3

2.4 細胞增殖活力

CCK-8實驗結果表明,與RNAi-NC組比較,下調OPN3后72 h時TE354T細胞RNAi-OPN3組增殖水平出現下降(P<0.05)。見圖4。

注:(1)與RNAi-NC組72 h比較,P<0.05。圖4 下調OPN3后各組人BCC細胞株TE354T細胞增殖水平的變化Fig.4 Changes in the proliferation of human BCC cell line TE354T cells in each group after down-regulation of OPN3

2.5 細胞遷移能力

細胞劃痕實驗結果顯示,與RNAi-NC組相比,下調OPN3 48 h后RNAi-OPN3組TE354T細胞遷移能力下降(P<0.05);Transwell遷移實驗結果顯示,與RNAi-NC組相比,干預后48 h時RNAi-OPN3組TE354T細胞遷移數量減少(P<0.05)。見圖5。

注:A、B分別為細胞劃痕實驗檢測結果及定量結果,C、D分別為Transwell遷移實驗檢測結果和定量結果;(1)與RNAi-NC組比較,P<0.05。圖5 下調OPN3后各組人BCC細胞株TE354T的細胞遷移和劃痕實驗(結晶紫染色, ×100)Fig.5 Cell migration and scratching experiments of human BCC cell line TE354T in each group after down-regulating OPN3 (crystal violet staining,×100)

2.6 細胞的凋亡

下調OPN3后流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,結果顯示,與RNAi-NC組比較,下調OPN3后RNAi-OPN3組中凋亡細胞數量增加(P<0.05)。見圖6。

注:A、B分別為流式細胞術的檢測結果和定量結果;(1)與RNAi-NC組比較,P<0.05。圖6 下調OPN3后各組人BCC細胞株TE354T的細胞凋亡Fig.6 Apoptosis of human BCC cell line TE354T in each group after down-regulation of OPN3

2.7 鈣依賴GPCR信號通路相關蛋白的變化

通過Western blot實驗檢測鈣通路的相關蛋白CREB、p-CREB、CAMKⅡ及p-CAMKⅡ的表達,結果表明,下調OPN3后,與RNAi-NC組相比,RNAi-OPN3組人BCC細胞株TE354T中p-CREB和 p-CAMKⅡ蛋白表達下降(P<0.05)。見圖7。

注:A、B分別為鈣通路相關蛋白的檢測結果和定量結果;(1)與RNAi-NC組比較,P<0.05。圖7 下調OPN3后各組TE354T細胞株中鈣通路相關蛋白的表達Fig.7 Expression of calcium pathway-related proteins in human BCC cell line TE354T after down-regulation of OPN3

3 討論

OPNs包括OPN1、OPN2、OPN3、OPN4及OPN5, 是一類光感受器,屬于GPCR超家族,廣泛參與細胞的增殖、分化、遷移[20]。既往研究中GPCR被證實在多種癌癥中起到調控作用,Du等[21]研究表明GPCR30在介導雌激素和他莫昔芬誘導的子宮內膜癌細胞的增殖和侵襲中起到了一定作用;張瑞華等[22]研究認為GPCR48基因表達對皮膚鱗狀細胞癌 (squamous cell carcinoma,SCC) 蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信號通路及細胞侵襲能力具有一定的影響。

OPN3作為GPCR家族中的一員,在肝癌、肺癌及結腸癌等多種癌癥中發揮重要作用。有研究認為,OPN3能通過調節細胞凋亡通路,從而使肝癌細胞對5-氟尿嘧啶治療敏感,主要機制是過表達OPN3后使磷酸化蛋白激酶B(protein kinases B,Akt)和B細胞淋巴瘤-2蛋白/Bcl-2相關X蛋白(B cell lymphoma-2 protein/Bcl-2-associated X protein,Bcl-2/bax)比值抗凋亡途徑失活[23];Xu等[10]研究顯示,OPN3可以促進肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)中的上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和腫瘤轉移;已有研究提示,OPN3作為光受體,可能是臨床上結腸癌的一個重要治療靶點,它首先證實了OPN3在結節型BCC病灶組的表達高于PANST組,為進一步探索OPN3表達變化對BCC的影響,接下來利用小干擾RNA靶向沉默人BCC細胞中的OPN3,細胞增殖活性、遷移能力、凋亡細胞數量都發生了明顯變化[24]。這些結果均表明OPN3可能在BCC的發生中起到了推動作用。

關于OPN3調控細胞的增殖、遷移及凋亡能力的機制,已有研究顯示,BCC的發生與遺傳存在一定相關性,其中MC1R基因多態性與基底細胞癌的風險之間存在一定遺傳聯系,且往往與皮膚顏色較深的人群相關性更大[24]。MC1R基因編碼的MCR1蛋白是一種參與黑色素生成的G蛋白耦合受體,MC1R基因變異可見于非黑色素瘤皮膚癌(non-melanoma skin cancer,NMSC)、日光性角化病及明顯的彈力纖維增生癥患者[25]。此外,BCC發生的高風險還與涉及刺鼠信號蛋白基因(agouti-signaling protein gene,ASIP)和酪氨酸酶相關(tyrosinase-related,TYR)基因的單核苷酸多態性有關,這些基因都與黑色素激素調節有關[26-27]。既往研究顯示,OPN3在調節MC1R的信號轉導時可作為黑色素生成的負調節因子[17]。另外有研究表明,GPCR可在黑素細胞內儲存中驅動鈣動員并參與下游信號級聯反應,且CAMKⅡ是鈣通道中的關鍵酶,CAMKⅡ的激活會導致CREB的磷酸化,p-CREB在介導環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)下游的CREB活化中發揮了一定作用,并且CREB是CAMKⅡ的主要下游靶標[18, 28]。還有研究顯示,紫外線誘導的活性氧(reactive oxygen species,ROS)主要通過絲裂原活化蛋白激酶/激活蛋白-1(mitogen-activated protein kinase/ activator protein-1,MAPK/AP-1)信號通路上調基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的表達[25]。本課題組前期結果也表明,鈣依賴性GPCR信號通路暴露于紫外線A(ultraviolet A,UVA)后,OPN3是負責上調正常人真皮成纖維細胞(normal human dermal fibroblasts,NHDF)MMP1、MMP2、MMP3及MMP9的關鍵傳感器[19]。因此可以推測,OPN3是否也是通過鈣通道進而調控基底細胞癌細胞的增殖、遷移及凋亡能力。因此,本研究采用Western blot檢測了鈣通道相關蛋白CREB、p-CREB、CAMKⅡ及pCAMKⅡ,結果表明,下調OPN3后p-CREB和p-CAMKⅡ表達下降。這表明OPN3可能正是通過鈣依賴信號轉導通路影響了下游CREB和CAMKⅡ的磷酸化,從而影響細胞的遷移、增殖以及凋亡。

綜上,本研究主要探討了OPN3在BCC中的表達及其功能,結果表明OPN3在人結節型BCC病灶中高表達,可能通過鈣依賴GPCR信號通路實現調控人BCC細胞的增殖、遷移及凋亡。但因本研究組織樣本量較小,可能致使研究有一定的偏倚。此外,OPN3究竟是如何通過鈣通道參與調控BCC細胞增殖、遷移及凋亡的具體機制目前尚不清楚,有待進一步的研究。