氟暴露下SH-SY5Y細胞ERK5信號轉導通路的改變*

邱志偉, 高峰,2, 陳從山,2, 張遠洋, 趙樂, 劉艷潔

(1.十堰市太和醫院 康復中心, 湖北 十堰 442000; 2.貴州醫科大學 臨床醫學院病理學教研室, 貴州 貴陽 550004)

分裂原激活蛋白激酶 (mitogen-activated proteinkinase,MAPK)家族信號系統廣泛存在于多種細胞,與神經退行性疾病有密切的關系[1-2],該系統可將細胞外刺激信號轉導至細胞內、或細胞核內,使細胞發生增殖、分化、轉化及凋亡,影響神經突觸的傳遞和神經元的重塑及形態分化,對學習記憶功能發生影響。有研究發現,MAPK信號轉導通路改變是慢性氟中毒性腦損傷機制中的重要參與因素[3]。ERK5(extracellular-sign1 regulated kinase 5)是 MAPK 系統中的重要組成部分,ERK5信號轉導通路也是 MAPK 信號轉導通路中較新的一條通路。細胞外調節蛋白激酶5,ERK55(extracellular-sign1regulated kinase 5,ERK5) 作為MAPK家族的一員[4],研究表明ERK5的活化對于細胞增殖、分化等生理過程是必需的[5],亦與許多疾病的發生有著一定的關系[6]。 氟離子可以通過血腦屏障在腦組織中蓄積、并造成中樞神經系統損害,長期攝入過量氟會影響神經細胞的正常生理功能,在地方性氟中毒病區的患者常出現記憶力減退、頭痛、頭暈及共濟失調等神經系統癥狀[7]。關于慢性氟中毒對神經損傷,在前期的研究較多[8],而ERK5信號轉導通路在氟中毒方面尚未見研究,本實驗通過復制24 h及48 h細胞模型,探討ERK5信號通路在氟中毒SH-SY5Y細胞中被激活的相關機制,報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞及主要試劑 SH-SY5Y細胞(德國German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司); DMEM 培養液(英國Gibco Invitrogen公司),胎牛血清(FBS,美國Hyclone 公司),二甲基亞砜(DMSO),氟化鈉(NaF,美國Sigma公司),培養細胞用青霉素-鏈霉素(美國Hyclone 公司),CC8K(日本同仁公司);Bio-rad電泳系統(美國Bio-Rad公司),磷酸化(p)-ERK5、總-ERK5及抗兔lgG(與辣根過氧化物酶聯,美國Cell Signaling 公司),ECL-plus發光試劑(瑞典Amersham公司),總蛋白提取試劑、RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

1.1.2主要儀器 mini垂直電泳槽、Power-pac 3000電泳儀(美國 Bio-Rad公司),Beckman 21R型冷凍離心機(美國 Beckman 公司),TS-92 型脫色搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司),ELX 800酶標儀(美國Bio-tec公司);總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司),Oligo dT(上海捷瑞生物工程有限公司)),cDNA合成試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司),DU640核酸定量儀(美國Beckman公司),PCR 儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.2 研究方法

1.2.1低、高劑量氟濃度篩選及分組 分別用不同劑量NaF處理SH-SY5Y細胞24、48 h,通過CCK8實驗篩選出氟中毒實驗濃度;以正常組SH-SY5Y細胞為參照,用低、高劑量氟分別處理SH-SY5Y細胞24、48 h,用實時熒光定量PCR檢測染氟48 h各組間ERK5 mRNA水平,用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各實驗組P-ERK5、ERK5的蛋白水平。

1.2.2SH-SY5Y細胞培養 SH-SY5Y神經細胞又稱人神經母細胞瘤細胞,應用于慢性氟中毒神經細胞模型的研究。將凍存細胞株復蘇,于37 ℃ CO2培養箱中培養,24 h后換培養基(含13%胎牛血清、1∶100雙抗的DMEM)繼續培養,觀察細胞生長狀態,待細胞長滿培養瓶底傳代繼續培養。

1.2.3CCK8法篩選染氟中毒實驗濃度 收集對數期正常SH-SY5Y細胞,調整細胞懸液濃度,每孔加入100 μL,鋪板使待測細胞密度達1 000～10 000個/孔[邊緣孔用無菌磷酸緩沖液(PBS)填充],37 ℃ 5%CO2孵育,至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),設置調零孔(包括培養液、CCK8)、對照孔(包括細胞 培養液、CCK8 ),進而加入氟化鈉(NaF,濃度梯度為0.000、0.100、0.200、0.300、0.400 、0.500、1.000 、2.000、3.000、4.000及5.000 mmol/L),設6個復孔;分別培養24、48 h后,每孔加入CCK8溶液10 μL,繼續培養2 h,終止培養,用酶標儀在波長570 nm處測量各孔的吸光度(OD)值,計算各實驗組細胞存活率,參照CCK8實驗步驟,正常SH-SY5Y細胞染氟后篩選合適的濃度。

1.2.4SH-SY5Y細胞染氟48 h時ERK5 mRNA表達 采用實時熒光定量PCR檢測細胞中ERK5信號通路中ERK5 mRNA表達。用Trizol一步法提取細胞總RNA,將mRNA逆轉錄反應成cDNA,以逆轉錄模板進行實時熒光定量PCR。ERK5的上游引物為5-CATTGTGGCTGAAATTGAGG,下游引物為3-CAGGGTCAGATCAATGGTGT-5,擴增產物長度220 bp;內參照β-actin的上游引物為5-TGGCACCACACCTTCTACAATG-3,下游引物為3-TCATCTTCTCGCGGTTGGC-5,擴增產物長度為103 bp。PCR體系為上下游引物各1.0μL, Maxima SYBR Green 10 μL, DNA 2.0 μL, ddH2O 6.0 μL),循環條件為反應條件為95 ℃ 10 min, 95 ℃ 15 s、 60 ℃ 1 min,40個循環。用β-actin作為內參,采用2-ΔΔCt法計算反應結果。

1.2.5SH-SY5Y細胞中磷酸化ERK5(p-ERK5)、總ERK5蛋白水平檢測 采用Western blot法檢測,提取細胞總蛋白,將細胞沉淀加入RIPA細胞裂解液,漩渦震蕩3次,每次5 min,冰上靜置15 min,反復3次,4 ℃ 14 000 r/min離心20 min,取上清液進行蛋白定量檢測。經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,再用轉膜裝置將膠上的蛋白轉到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上,先分別用p-ERK5蛋白、總ERK5蛋白(1∶1 000)與轉蛋白膜孵育4 ℃過夜,再與辣根過氧化物酶聯結的抗兔IgG室溫孵育2 h。將膜與ECL-plus發光試劑反應5 min,用顯影膠片曝光,沖洗膠片后用Imagej圖像分析儀處理,用β-actin作為內參,計算反應結果。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 染氟濃度的篩選

染氟24 h時,0.100 mmol/L NaF處理組細胞存活率較對照組(0.000 mmol/L NaF)升高,0.400～5.000 mmol/L NaF處理組的細胞存活率較對照組降低,差異有統計學意義(P<0.05);染氟48 h時, 0.100 mmol/L NaF處理組細胞存活率較對照(0.000 mmol/L NaF)組升高,0.300～5.000 mmol/L NaF處理組的細胞存活率較對照組降低,差異有統計學意義(P<0.05)。綜合選擇0.5 mmol/L NaF 實驗組作為低劑量染氟組、染氟1.0mmol/L實驗組作為高劑量染氟組,復制神經細胞慢性氟中毒模型。見表1。

表1 氟化鈉對SH-SY5Y細胞活力的影響Tab.1 Effect of NaF on the activity of SH-SY5Y

2.2 ERK5mRNA表達水平

ERK5mRNA實時熒光定量采用2-ΔΔCt法計算,染氟0.0、0.5、1.0 mmol/L NaF 48 h后,正常組、低氟組、高氟組ERK5mRNA表達水平任意組間比較無統計學意義(F=1.114,P>0．05),其中β-actin和 ERK5基因的溶解曲線和擴增曲線良好,見表2和圖1～4。

圖1 SH-SY5Y細胞染氟48 h 時β-actin Real-Time-PCR的擴增曲線Fig.1 β-actin amplification curves of Real-Time-PCR of SH-SY5Y exposed to fluoride 48 h

圖2 SH-SY5Y細胞染氟48 h時β-actin Real-Time-PCR的溶解曲線Fig.2 β-actin dissolution curves of Real-Time-PCR of SH-SY5Y exposed to fluoride 48 h

圖3 SH-SY5Y細胞染氟48 h時 ERK5基因Real-Time-PCR的擴增曲線Fig.3 ERK5 amplification curves of ERK5 gene Real-Time-PCR of SH-SY5Y exposed to fluoride 48 h

圖4 SH-SY5Y細胞染氟48 h時 ERK5 Real-Time-PCR的溶解曲線Fig.4 ERK5 dissolution curves of Real-Time-PCR of SH-SY5Y exposed to fluoride 48 h

表2 SH-SY5Y細胞染氟48 h時ERK5mRNA表達水平Tab.2 ERK5 mRNA expression level of SH-SY5Y after 48 h of fluoride

2.3 ERK5蛋白表達檢測結果

染氟24 h,高氟組P-ERK5蛋白水平較低氟組、正常組表達升高(F=6.237,P<0.05),而總ERK5蛋白表達水平高氟組升高較低氟組、對照組有意義(F=14.731,P<0.05)。見表3和圖5。染氟48 h后,染氟組P-ERK5表達逐漸升高,各組間比較均有統計學意義(F=46.913,P<0.05),且總ERK蛋白表達水平也逐漸增加,染氟組較正常組有統計學意義(F=17.877,P<0.05)。見表3和圖6。

注:1、2、3分別表示對照組、低氟組、高氟組,Mr為相對分子質量,Ⅱa為Phospho-ERK5,Ⅱb為Total-ERK5。圖5 SH-SY5Y細胞染氟24 h時P-ERK5、ERK5激酶表達Fig.5 Effect of 24 h after fluoride exposure on the expression of P-ERK5 and ERK5 kinase

注:1、2、3分別表示對照組、低氟組、高氟組 ,Mr為相對分子質量,Ⅱa為Phospho-ERK5,Ⅱb為Total-ERK5。圖6 SH-SY5Y細胞染氟48 h時P-ERK5、ERK5激酶表達Fig.6 Expression of P-ERK5 and ERK5 in SH-SY5Ycells at 48 hours after fluoride exposure

表3 SH-SY5Y細胞中P-ERK5、ERK5蛋白表達水平Tab.3 Levels of P-ERK5 and ERK5 protein expression

3 討論

地方性氟中毒(endemic fluorosis)是由于一定地區的環境中氟元素過多,而致生活在該環境中的居民經飲水、食物和空氣等途徑長期攝入過量氟所引起的以氟骨癥(skeletal fluorosis)和氟斑牙(dental fluorosis)為主要特征的一種慢性全身性疾病[9],高氟對人體神經、肌肉骨骼等系統造成慢性損害,危害較大。

研究表明,慢性氟中毒動物的神經細胞存在退行性改變,而長期攝入高氟可造成過量氟在腦內儲留,可能導致神經細胞發育分化異常,影響腦細胞的正常生理功能,從而引起大腦皮質及海馬神經元病理改變。人體的大腦皮質枕葉區和額葉區、海馬區都是參與學習記憶和智力功能的重要結構,海馬區的作用不僅僅是制造記憶,而是記憶“存儲器”[10],已有研究表明慢性氟中毒大鼠學習記憶能力降低, 其與神經細胞的改變關系密切。

慢性氟中毒時FCM術檢測表明,大腦皮層及海馬神經細胞凋亡率升高,明顯影響細胞周期S期(DNA合成期),進入S期的神經元數量顯著減少[11],ERK5可以抑制凋亡,這也是在正常情況下ERK5的主要生理功能,實驗也證明c-fos介導了ERK5的抗凋亡作用, ERK5的激活可抑制腦缺血損傷時的神經細胞凋亡、產生神經保護作用。研究表明,阻斷ERK5會下調細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白E和CDK4等的表達,導致細胞周期停滯于G1期和生長抑期[12],ERK5信號轉導通路在中樞神經系統廣泛表達,各種細胞外刺激信號可通過這條通路影響突觸傳遞、神經元的重塑、形態分化等[13-14],同時ERK5的活化對細胞增殖、分化等生理過程是必需的[15]。有研究發現ERK5可以被VEGF激活,調控VEGF介導的促凋亡蛋白BAD的磷酸化,增加抗凋亡蛋白BCL2的表達,ERK5可以促進細胞生存,抑制凋亡[16-17],這也是其正常情況下的主要功能。

本研究通過復制神經細胞慢性氟中毒模型,隨著染氟劑量和染氟時間的延長,ERK5的基因水平未發現改變,而發現染氟組中磷酸化ERK5的表達水平逐漸增高,而ERK5激酶的表達水平也慢慢增加,且P-ERK5的激活較明顯,表明P-ERK5激酶對慢性氟中毒神經細胞損傷中起到關鍵的代償性作用,提示ERK5信號通路很可能在氟中毒腦損傷過程中起到一定的抗凋亡作用。

此外,自由基損傷是氟中毒神經性腦損傷中的重要機制,中樞神經系統神經元的氧化應激級聯與大量的自由基釋放有關[18],而ERK5是氧化應激激酶,ERK5也是毒性物質通過通路,作為中間環節,與信息傳遞、細胞的正常功能有關。研究表明,ERK5激活與自由基密切相關,隨著染氟時間延長,p-ERK5和 ERK5代償性增高,參與和調節神經系統功能[ 19-21],表明p-ERK5和 ERK5有可能參與了氟中毒引起的神經損傷,但p-ERK5和ERK5的激活對自由基引起的組織或細胞損傷起到保護作用,起到正向性調節代償作用,且p-ERK5的代償作用更為及時更為主要,它們有可能是氟中毒神經細胞損傷過程中的重要參與因素, 這些改變可能僅僅是過量氟導致細胞信息傳遞變化的部分環節。

近幾年關于氟中毒學習記憶力降低的報道較多,ERK是多種屬動物多種學習記憶形式的主要分子[22-23],而ERK5信號通路在氟中毒神經細胞中被激活[24],雖然科學家目前對于記憶的運作機制的了解還不夠,而神經細胞突觸的形成也與記憶相關聯(這一機制對于理解我們自身是非常重要的),ERK5信號通路參與神經突觸的形成[25],故ERK5信號通路很可能與維持細胞正常生理功能及學習記憶能力的關系較為密切[26]。

SHSY-5Y細胞在地方性氟中毒模型的應用中較多[27-28],本實驗表明ERK5信號通路很可能介導了慢性氟中毒神經細胞損傷的保護作用,與大腦學習記憶能力可能有重要的相關關系,ERK5信號通路在慢性氟中毒腦損傷被激活,其很可能是慢性氟中毒性神經性腦損傷機制中的重要參與因素,其與慢性氟中毒神經興奮性毒性[ 29]的代償性保護機制值得進一步深入研究。