異丙酚對卵巢癌進展和順鉑敏感性的影響及機制*

劉琴, 王莉娜, 代委桀, 黃浩, 袁茜

(自貢市婦幼保健院 麻醉科, 四川 自貢 643000)

卵巢癌是女性最常見的三大惡性腫瘤之一,死亡率位居女性腫瘤的榜首,因早期癥狀不明顯難以被準確診斷,發病率呈逐年上升趨勢。卵巢癌根據病理類型不同,治療方法有所差異,但大多采用手術結合化療進行治療[1-3]。由于卵巢癌具有易產生多藥耐藥的生物學特性,因此尋找靶點精確、治療高效、毒性較低的化療藥物以及有效的化療藥物增敏劑逐步成為腫瘤研究領域的熱點[4]。順鉑(cis-platinum,DDP)及其同類藥物在臨床治療惡性腫瘤方面已得到廣泛應用,并取得良好治療效果,但DDP具有濃度依賴性的弊端,即短時間內給藥濃度越大,療效越高[5]。DDP本身性質決定其在抑制腫瘤生長的同時,具有耳毒性、腎毒性及神經毒性等強烈副作用,當給藥濃度過大時,極易造成患者強烈不耐受,因此治療過程中需對DDP濃度進行嚴格把控,導致的直接結果之一便是因限制DDP最大劑量而造成的療效下降[6-7]。異丙酚對卵巢癌細胞具有抑制作用,但和其他化療藥相同,也面臨著藥物耐藥性這一嚴峻問題。因此,尋找能夠增加化療藥敏感性,降低耐藥可能性對于臨床化療具有非常重要的臨床現實意義。已有研究顯示,異丙酚在肝細胞中可減緩DDP副作用,對減輕藥物依賴性具有正向作用,目前應用于卵巢癌的研究僅限于探討其對卵巢癌細胞侵襲和轉移的機制[8-9],但能否在卵巢癌細胞中顯示出減少DDP細胞毒性作用、提高對DDP耐藥的敏感度尚需探究,因此本研究通過觀察異丙酚對卵巢癌細胞進展、腫瘤惡性生物學行為及DDP敏感性的影響,旨在為完善卵巢癌臨床化療方案提供有效依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株和實驗動物 卵巢癌細胞A2780和耐DDP卵巢癌細胞A2780(A2780/DDP)均購自上海慧穎生物科技有限公司;BALC/c裸鼠20只,雌性,無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級,5～7周齡,體質量(200±20)g,由四川省醫學科學院&四川省人民醫院實驗動物研究所提供[生產許可SCXK(川)2018-15]。

1.1.2主要試劑 異丙酚(西安力邦制藥有限公司,國藥準字H20040300,規格50 mL∶500 mg),DDP(齊魯制藥有限公司,國藥準字H37021357,規格20 mg),RPMI-1640培養基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;美國GIBCO公司),細胞計數試劑(cell counting kit-8,CCK-8)檢測試劑盒(上海經科化學科技有限公司),辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)標記兔抗鼠二抗、β-actin鼠單克隆抗體、大鼠B細胞淋巴瘤-XL(rat B-cell lymphoma -XL,Bcl-xl)單克隆抗體、細胞凋亡調節因子(bcl-2interactingmediatorofcelldeath, Bim)單克隆抗體及活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)單克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.1.3主要儀器 CO2培養箱(美國Thermo Fisher Scientific),奧林巴斯BX53型生物顯微鏡和C2500-R-230V微型高速離心機(美國Labnet),Multiskan MK3全自動酶標儀(美國Thermo scientific)及FACS Calibur流式細胞分析儀(美國BD)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養及分組 采用含體積分數10%FBS的RPMI-1640培養基復蘇A2780和A2780/DDP細胞、傳代培養至對數生長期(2×106個/L),細胞分為Control組(等量培養基)、異丙酚組(加10 mg/L 異丙酚)、DDP組(加10 μmol/L DDP)及異丙酚+DDP組(加10 mg/L異丙酚及10 μmol/L DDP),置于pH 7.0～7.2的37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.2CCK-8法檢測細胞的增殖 取對數生長期的A2780和A2780/DDP細胞接種于96孔培養板中,分別與0、1、5、10、20 mg/L異丙酚及0、5、10、20、40、80 μmol/L DDP進行孵育,預培養于37 ℃、5% CO2培養箱,加CCK-8溶液10 μL/孔,培養4 h,在波長為450 nm處,檢測各孔的吸光度值,繪制細胞生存率隨濃度變化的生長曲線。

1.2.3克隆形成實驗檢測細胞生長 取“1.2.1”項下各組對數生長期A2780和A2780/DDP細胞接種于96孔培養板中,37 ℃的5% CO2培養箱中培養24 h,采用多聚甲醛(質量分數4%)室溫固定10 min,1%結晶紫染色5 min,顯微鏡下觀察每孔內細胞克隆數目,計算克隆細胞數。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 利用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化收集“1.2.1”項下各組對數生長期A2780和A2780/DDP細胞,終止消化后清洗細胞;加Binding Buffer 結合緩沖液 500 μL、異硫氰酸熒光素5 μL、碘化丙啶 5 μL,避光 10 min,使用流式細胞儀檢測,CellQest軟件分析各組細胞的凋亡情況。

1.2.5Western blot檢測凋亡蛋白表達 利用Western blot檢測Bcl-xl、Bim及cleaved caspase-3蛋白表達水平。分別取“1.2.1”項下各組對數生長期A2780和A2780/DDP細胞,加放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay, RIPA)裂解液提取總蛋白,采用Beyotime細胞質蛋白提取試劑盒提取細胞質蛋白,Beyotime核蛋白提取試劑盒獲得核蛋白,將蛋白質進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分離,轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜;孵育膜與封閉緩沖液,洗滌,加一抗Bcl-xl(1∶2 000)、Bim(1∶2 000)、cleaved caspase-3 (1∶2 000),4 ℃孵育過夜。洗膜,使用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)偶聯的二抗(1∶5 000)孵育膜,室溫孵育2 h,洗膜,電化學發光顯像,β-actin為內參,采用凝膠圖像分析系統對比條帶強弱。

1.2.6Transwell檢測細胞的侵襲 取“1.2.1”項下各組對數生長期A2780和A2780/DDP細胞,以無血清RPMI-1640培養基稀釋至5×108個/L, Matrigel基質膠100 μL與無血清培養基500 μL充分混合,吸取50 μL置于上室,恒溫37 ℃靜置4 h,下室加含10 % FBS的RPMI-1640培養基500 μL,培養24 h,無菌棉簽除去多余細胞,甲醛固定15 min,結晶紫染色15 min,顯微鏡觀察并記錄遷移的細胞數。

1.2.7裸鼠移植瘤實驗 SPF條件下,20只裸鼠皮下注射卵巢癌A2780細胞株(8×109個/L)0.2 mL,構建人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。造模成功后的裸鼠均分為Control組(等量生理鹽水)、異丙酚組(10 mg/L 異丙酚)、DDP組(10 μmol/L DDP)及異丙酚+DDP組(10 mg/L異丙酚及10 μmol/L DDP),以上各處理均為腹腔注射、100 mg/(kg·次)、1次/2 d;每隔5 d采用卡尺測量各組裸鼠移植瘤瘤體長短徑并計算體積,觀察30 d;第30天處死全部裸鼠,剝離腫瘤稱量瘤體質量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞活力

與同類細胞0 mg/L組相比,5、10及20 mg/L組A2780、A2780/DDP細胞株細胞活力均明顯下降(P<0.05);A2780/DDP細胞系半抑制濃度(50% inhibiting concentration,IC50)為(16.63±2.39)mg/L,高于A2780細胞系[(13.27±1.68)mg/L,P<0.05]。DDP>5 μmol/L時A2780細胞株細胞活力隨濃度上升而下降(P<0.05),DDP>10 μmol/L時A2780/DDP細胞株細胞活力隨濃度上升而下降(P<0.05);A2780/DDP細胞系IC50為(43.91±3.78)μmol/L,高于A2780細胞系[(14.31±1.05)μmol/L,P<0.05];與A2780/DDP細胞系相比,不同濃度異丙酚和DDP下的A2780細胞系細胞存活率較低。見圖1。

注:A、B為不同濃度異丙酚下細胞存活率和IC50值,C、D為不同濃度DDP下細胞存活率和IC50值;(1)與同類細胞1 mg/L組比較,P<0.05;(2)與同濃度A2780組比較,P<0.05。圖1 不同濃度異丙酚和DDP對A2780、A2780/DDP細胞活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of propofol and DDP on the activity of A2780 and A2780/DDP cells

2.2 細胞毒性作用

與Control組相比,異丙酚組和DDP組A2780、A2780/DDP細胞系細胞活力和細胞克隆數均下降(P<0.05);與DDP組相比,異丙酚+DDP組A2780、A2780/DDP細胞系細胞活力和細胞克隆數均下降(P<0.05);與A2780/DDP細胞系相比,A2780細胞系細胞克隆數較低。見圖2。

注: A、B為細胞A2780和A2780/DDP的細胞存活率;C、D為細胞克隆形成(結晶紫染色,×40)及其定量結果;(1)與Control組比較,P<0.05;(2)與DDP組比較,P<0.05。圖2 異丙酚增強DDP對A2780、A2780/DDP細胞系細胞毒性作用Fig.2 Effects of propofol-enhanced DDP on cytotoxicity of A2780 and A2780/DDP cell lines

2.3 DDP敏感性

異丙酚組和DDP組A2780、A2780/DDP細胞凋亡率均較Control組上升(P<0.05),異丙酚+DDP組A2780、A2780/DDP細胞凋亡率均較DDP組上升(P<0.05),A2780細胞系細胞凋亡率較A2780/DDP細胞系高(P<0.05);異丙酚組和DDP組A2780、A2780/DDP細胞中Bim和cleaved caspase-3表達均較Control組上升、Bcl-xl表達則下降(P<0.05),異丙酚+DDP組A2780、A2780/DDP細胞中Bim和cleaved caspase-3表達均較DDP組上升、Bcl-xl表達則下降(P<0.05)。見圖3。

注:A、B為流式細胞儀檢測結果及定量結果,C、D為各組A2780細胞中凋亡相關蛋白表達及定量結果,E、F為各組A2780/DDP細胞中凋亡相關蛋白表達及定量結果; (1)與Control組比較,P<0.05;(2)與DDP組比較,P<0.05。圖3 各組A2780和A2780/DDP細胞的凋亡率及凋亡相關蛋白的表達Fig.3 Apoptosis rate and apoptosis-related protein expression of A2780 and A2780/DDP cells in each group

2.4 細胞侵襲實驗結果

與Control組相比,異丙酚組和DDP組A2780、A2780/DDP細胞侵襲率均下降(P<0.05);與DDP組相比,異丙酚+DDP組A2780、A2780/DDP細胞侵襲率均下降(P<0.05)。見圖4。

注:A、B為細胞A2780的細胞侵襲染色結果和定量結果,C、D為細胞A2780/DDP的細胞侵襲染色結果和定量結果;(1)與Control組比較,P<0.05;(2)與DDP組比較,P<0.05。圖4 各組A2780和A2780/DDP細胞侵襲實驗結果(結晶紫染色法,×400)Fig.4 Results of inhibiting invasion in A2780 and A2780/DDP cells of each group(crystal violet staining,×400)

2.5 裸鼠移植瘤實驗

與Control組相比,異丙酚組、DDP組和異丙酚+DDP組裸鼠腫瘤質量明顯下降(P<0.05);與DDP組相比,異丙酚+DDP組裸鼠腫瘤質量明顯下降(P<0.05);各組腫瘤體積隨時間增加而增加,第30天時異丙酚組、DDP組和異丙酚+DDP組裸鼠腫瘤體積小于Control組(P<0.05),異丙酚+DDP組裸鼠腫瘤體積小于DDP組(P<0.05)。見圖5。

注:A為體外移植瘤,B為移植瘤質量,C為移植瘤體積與時間變化的關系曲線;(1)與Control組比較,P<0.05;(2)與DDP組比較,P<0.05。圖5 異丙酚增強DDP對體內腫瘤生長的抑制作用Fig.5 Propofol increased inhibition effect of tumors growth in vivo by enhancing DDP

3 討論

異丙酚是近年臨床應用廣泛于麻醉誘導、靜脈鎮靜的藥物,但目前研究發現其作用遠不止于此。卵巢癌的發生發展與許多信號通路有關,已有大量研究證實異丙酚能夠通過調節這些信號抑制卵巢癌細胞侵襲、遷移和血管生成等惡性生物學行為。腫瘤治療中也面臨耐藥性的問題[10-15],既往研究顯示,異丙酚能夠抑制卵巢癌耐藥細胞增殖,提高耐藥細胞株對藥物的敏感度[16]。為了驗證異丙酚是否提高DDP耐藥的卵巢癌細胞的敏感性,進行了本研究。

本研究結果顯示,與同細胞1 mg/L組相比,3、4、5 mg/L組A2780、A2780/DDP細胞株細胞活力均下降,A2780/DDP細胞系IC50高于A2780細胞系。說明一定濃度的異丙酚能夠抑制卵巢癌細胞生長,對DDP耐藥株也有抑制效果,但所需濃度更高。 A2780/DDP細胞系IC50高于A2780細胞系,說明DDP對敏感A2780細胞株顯示出良好的抑制生長作用,但對DDP耐藥的A2780/DDP細胞株需要提高DDP濃度才能發揮抑制生長作用。與A2780/DDP細胞系相比,不同濃度異丙酚和DDP下的A2780細胞系細胞存活率均較低,說明異丙酚和DDP對敏感卵巢癌細胞具有更好抑制作用,但這種抑制作用會因卵巢癌細胞對DDP耐藥而降低,提示臨床應合理用藥進行化療,避免出現耐藥而導致治療進展困難[17]。本研究結果顯示,與Control組相比,異丙酚組和DDP組A2780、A2780/DDP細胞系細胞活力和細胞克隆數均下降;說明異丙酚和DDP干預均能夠明顯抑制卵巢癌細胞的細胞活力。當同時加入異丙酚和DDP時,A2780、A2780/DDP細胞系細胞活力和細胞克隆數相較于加入單一藥物干預進一步下降,說明異丙酚能夠增強DDP對敏感和耐藥A2780細胞系的細胞毒性作用,發揮協同作用,發揮更強大的抑制作用。

本研究結果顯示,與Control組相比,異丙酚組和DDP組A2780、A2780/DDP細胞凋亡率均上升,說明異丙酚和DDP能夠促進細胞凋亡,延緩卵巢癌細胞進展;與DDP組相比,異丙酚+DDP組A2780、A2780/DDP細胞凋亡率均上升,揭示異丙酚能夠通過促進細胞凋亡的方式,增強敏感和耐藥A2780細胞系對DDP的敏感性,從而發揮腫瘤抑制作用。既往研究表明,異丙酚能通過調控miRNA表達,抑制MAPK/ERK信號通路的關鍵蛋白p-MAPK及p-ERK表達等途徑促進腫瘤細胞凋亡[18],與本研究結果基本一致;與A2780/DDP細胞相比,A2780細胞總是顯示出更高的凋亡率,說明無論是使用單一藥物干預還是組合干預,敏感腫瘤細胞的抑制作用均強于耐藥腫瘤細胞系;通過加入異丙酚,DDP耐藥卵巢癌細胞的細胞凋亡率增加,說明異丙酚能夠提高DDP敏感性,在實際臨床應用中,或許能夠增強長期使用DDP化療方案,有DDP耐藥傾向和已經發生DDP耐藥患者的治療效果。

通過研究凋亡相關蛋白的表達與異丙酚的關系,可以從蛋白表達角度建立細胞凋亡和異丙酚的關系,進一步探究異丙酚的加入是否與DDP敏感性的提高有關。與Control組相比,異丙酚組和DDP組A2780、A2780/DDP細胞中Bim和cleaved caspase-3表達均上升,Bcl-xl表達下降。Bcl-2家族是公認的與細胞凋亡過程緊密相關的凋亡調節蛋白,通過調控線粒體細胞凋亡途徑介導細胞凋亡[19]。Bim屬于含有一個BH結構域的Bcl-2家族成員,目前發現多達19種亞型,具有不同促凋亡活性,研究表明Bim基因多態性對晚期NSCLC行鉑類藥物化療的患者預后產生明顯影響[20-21],因此推測這種影響一定程度上會在卵巢癌細胞中延續。Bcl-xl屬于Bcl-2蛋白家族抗凋亡成員,目前公認細胞凋亡主要由死亡受體通路和線粒體兩條通路構成,其共同組成部分則為Caspase激活,使得Caspase-3在細胞凋亡過程中具有不可替代的地位[22-23]。正常情況下,Caspase-3以procaspase的形式存在體內,當受到刺激后,Caspase-3被多種因素活化,活化后的Caspase-3快速參與細胞凋亡過程[24-25]。本研究結果表明異丙酚和DDP能夠通過上調Bim表達誘導細胞凋亡,激活Caspase-3活化過程,使DDP耐藥腫瘤細胞株也發生細胞凋亡,促進了DDP治療作用的提高,有利于對抗DDP耐藥性造成的治療效果不佳。與DDP組相比,A2780、A2780/DDP細胞中Bim和cleaved caspase-3表達均明顯上升,Bcl-xl表達明顯下降,說明異丙酚能夠通過調控細胞凋亡相關蛋白的表達水平,介導腫瘤細胞凋亡,提高敏感和耐藥細胞株對DDP的敏感性,從而發揮腫瘤抑制作用,對抗因發生耐藥性引起的治療效果下降。

本研究結果顯示,與Control組相比,異丙酚組和DDP組A2780、A2780/DDP細胞侵襲率均下降,異丙酚+DDP組A2780、A2780/DDP細胞侵襲率進一步下降,揭示異丙酚和DDP能夠抑制腫瘤細胞侵襲,而異丙酚能通過抑制侵襲行為增強敏感和耐藥A2780細胞系對DDP的敏感性。既往研究證實,異丙酚可以通過調控miR-212-5p/TRPV6軸,影響卵巢癌細胞增殖遷移及侵襲過程,抑制卵巢癌轉移[26]。由于加入異丙酚能夠提高DDP耐藥A2780細胞系的侵襲和潛移作用,因此對于異丙酚增加DDP敏感性具有一定說服力,異丙酚增加DDP敏感性從而發揮腫瘤治療效果的途徑之一是抑制腫瘤細胞惡性生物學行為。

裸鼠移植瘤實驗結果顯示,與Control組相比,異丙酚組和DDP組裸鼠腫瘤質量和腫瘤體積均明顯下降,異丙酚+DDP組裸鼠腫瘤質量和腫瘤體積下降更明顯,提示異丙酚和DDP能抑制體內腫瘤生長,而異丙酚進一步增強了DDP對體內腫瘤生長的抑制作用。

綜上所述,本研究立足于探討異丙酚干預對卵巢癌細胞進展的影響及異丙酚增加DDP敏感性的作用機制,從藥物作用濃度、增加DDP細胞毒性作用、增加細胞凋亡率及抑制細胞侵襲幾個方面進行闡述,揭示了異丙酚干預對卵巢癌細胞系A2780及耐藥A2780細胞系的抑制作用。