烏骨藤對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠IL-33/ST2信號通路的影響*

祝波, 馬武開, 陳菲菲, 楊玉濤, 安陽, 高雪琴, 劉振昆, 黃穎**

(1.貴州中醫(yī)藥大學 第二臨床醫(yī)學院, 貴州 貴陽 550002; 2.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 風濕免疫科,貴州 貴陽 550001; 3.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 體檢治未病中心, 貴州 貴陽 550001)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以對稱性多關節(jié)滑膜炎癥為特征的慢性、全身性自身免疫性疾病[1],疾病后期可導致軟骨和骨破壞,影響關節(jié)功能,造成關節(jié)畸形,嚴重影響個人生活質(zhì)量,導致巨大的經(jīng)濟負擔[2]。RA在我國的發(fā)病率0.42%,女性高于男性[3]。研究表明,RA與遺傳因素、環(huán)境因素、炎癥反應及自身免疫等因素有關,認為與輔助T細胞(Th1、Th2及Th17)及其相關細胞因子的異常激活有關[4]。Th1細胞主要參與細胞的炎癥反應,并激活巨噬細胞,產(chǎn)生白細胞介素-2(interleukin 2,IL-2)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和γ干擾素(interferon-γ,INF-γ);Th2細胞激活B細胞,并產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10;Th17細胞受轉(zhuǎn)錄因子維甲酸受體相關孤兒受體γt(RORt)調(diào)節(jié),主要產(chǎn)生IL-17、IL-22和INF-γ[5]。IL-33是一種前炎性細胞因子,可通過生長刺激表達基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2,ST2)軸募集一系列的炎性因子,促進機體炎癥的發(fā)展[6]。當機體受到刺激時,IL-33與其受體ST2結(jié)合后通過相應免疫通路參與炎癥、自身免疫心血管疾病的生和發(fā)展[7-8]。目前,西醫(yī)治療RA主要采用糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥及改善病情抗風濕藥等藥物[9-10],中醫(yī)藥治療RA有其特色、臨床效果顯著、不良反應少及安全性高[11]。烏骨藤具有抗炎、抗腫瘤及抗纖維化等藥理作用[12],常用于治療風濕痹痛,但作用及機制尚未見報道,本研究通過建立膠原誘導性關節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型大鼠,探討烏骨藤對CIA大鼠IL-33/ST2信號通路相關因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 60只SPF級6周齡健康雌性Wistar大鼠,體質(zhì)量(180±20)g,購自長沙天勤生物技術有限公司,動物合格證號SCXK(湘)2019-0013。所有大鼠在相同條件下喂養(yǎng),自由飲食、飲水,室溫18～22 ℃。

1.1.2實驗藥物及試劑 烏骨藤片(四川國康藥業(yè)有限公司,批號20200914165023)、氟米特片(蘇州長征一欣凱制藥有限公司,批號201202)、牛Ⅱ型膠原(美國Chondrex公司,批號20021),完全弗氏佐劑(美國Sigma公司,批號F-5881)、醋酸(國藥集團化學試劑有限公司,批號10000218),IL-4 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號E-EL-R0014c)、IL-17 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號E-EL-R0566c)、INF-γ ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號E-EL-R0009c)、L-33 ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司,批號CSB-E14077r);小鼠單抗β-actin 42 kD(武漢博士德生物工程有限公司,批號BM0627)、兔多抗sst 241 kD(批號Df7206)、兔多抗st2 l63 kD(批號Df2533)、兔多抗IL-33 31 kD(批號Df8319)均為美國Affinity公司產(chǎn)品。

1.1.3實驗儀器 離心機(湘儀H1650-W)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONEICV-450)、FlexStation3多功能酶標儀(Molecular Devices,Flex Station3)、電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司CPA)、水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司TS-1)。

1.2 研究方法

1.2.1實驗分組 60只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、來氟米特組及烏骨藤低、中、高劑量組,每組10只。

1.2.2動物造模及關節(jié)炎評分 除空白組外,其余各組參照文獻[13]方法建立CIA大鼠動物模型。用0.1 mol/L冰釋酸5 mL稀釋10 mg牛Ⅱ型膠原溶解過夜,然后加入等體積的完全氟氏佐劑中,于大鼠尾根皮下多點注射0.3 mL,第7天后以同樣方法再注射1次。第7天開始對大鼠踝關節(jié)、跖趾關節(jié)、趾關節(jié)紅腫程度進行炎癥評分,評分之和用關節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)表示,AI≥4分為關節(jié)炎癥誘導成功,AI<4分判定為沒有關節(jié)炎癥發(fā)生[14]。

1.2.3給藥 各組大鼠從造模第8天開始灌胃給相應藥,按人與大鼠體重換算,以等效劑量為烏骨藤中劑量、其1/3劑量為低劑量、3倍劑量定為高劑量,烏骨藤低、中、高劑量組分別給予3 570、7 500、15 000 mg/(kg·d)灌胃;來氟米特組劑量為2 mg/(kg·d),空白組及模型組灌胃等體積生理鹽水,每日灌胃1次,持續(xù)灌胃給藥28 d。

1.2.4實驗取材 取材于第28天末次灌胃后,予烏拉坦腹腔麻醉后行腹主動脈取血,3 000 r/min離心15 min,取上清液置-80 ℃冰箱保存;留取雙后肢膝關節(jié)滑膜組織,取部分滑膜樣本(0.1 g),置入PBS 1 mL 中,4 ℃搗碎勻漿,3 000 r/min離心10 min取上清,-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標

1.3.1一般觀察 動物精神、步態(tài)、被毛、活動情況、飲食及飲水量、糞便。

1.3.2AI 建模后第7天開始對大鼠踝關節(jié)、跖趾關節(jié)、趾關節(jié)紅腫程度進行炎癥評分,采用5級評分法:0分,無關節(jié)發(fā)紅;1分,趾關節(jié)發(fā)紅;2分,趾關節(jié)和足跖腫腫脹;3分,踝關節(jié)、趾關節(jié)和足跖關節(jié)腫脹;4分,踝關節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹;每個關節(jié)最高分為4分,4個關節(jié)累及積分記為每只大鼠的總分,分別計算各組大鼠灌胃前及灌胃第1、2、3、4周時AI。

1.3.3血清IL-4、IL-17、IL-33及INF-γ的水平 按試劑盒說明書操作,先加入標準品和待測樣品,設置空白對照,37 ℃溫育90 min,棄去孔內(nèi)液體,加入生物素化抗體工作液,37 ℃溫育60 min,加酶結(jié)合物工作液,37 ℃溫育30 min,洗板5次,加顯色劑,37 ℃避光孵育15 min,加入終止液,上酶標儀檢測光密度D值,每組設5個復孔,重復3次,取平均值。

1.3.4大鼠膝關節(jié)滑膜組織中sST2、ST2L、IL-33蛋白表達水平 取出適量膝關節(jié)滑膜組織低溫勻漿后加蛋白裂解液,在冰上裂解30 min,離心5 min、4 ℃,12 000 r/min,取上清。以BSA為標準,用Bradford法對上清液進行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品,10% SDS-PAGE電泳,設置恒壓25 V轉(zhuǎn)模。用封閉液(TBST)浸泡PVDF膜,室溫封閉2 h,4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5次,5 min/次,加入稀釋好的二抗,室溫搖床孵育2 h。再用TBST洗膜5次,5 min/次。ECL發(fā)光顯影,用Band Scan分析膠片灰度值。

1.3.5檢測大鼠膝關節(jié)滑膜組織中sST2、ST2L、IL-33基因表達水平 Trizol法提取RNA:取膝關節(jié)滑膜組織100 mg,加入Trizol試劑1 mL,用勻漿器萃取組織,移至無RNase的1.5 mL EP管中,裂解10 min。加入氯仿200 μL,劇烈顛倒混勻數(shù)次,室溫放置5 min。4 ℃,12 000 r/min,8 min,轉(zhuǎn)移上層水相至另一離心管,加入400 μL異丙醇,混勻,室溫靜置10 min。4 ℃,12 000 r/min,離心10 min。棄上清,加入75%乙醇,渦旋混勻,離心5 min(4 ℃,10 000 r/min)。棄上清,室溫干燥5～10 min。加入20 μL DEPC水溶解RNA。取RNA2 μL,用顯微分光光度計測量D260、D280、D260/D280值,計算RNA純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄條件:50 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 10 min,用相對定量Ct值法(2-ΔΔCt法)對數(shù)據(jù)進行定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence of real-time PCR

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

空白組大鼠隨著飼養(yǎng)時間的延長,精神狀態(tài)良好,皮毛正常有光澤,活動自如,飲食飲水佳。模型組大鼠精神日漸萎靡,行走逐漸困難,毛發(fā)無光澤,飲水及飲水量減少。來氟米特組和烏骨藤不同劑量組大鼠的精神狀態(tài)、營養(yǎng)狀況和關節(jié)活動能力均優(yōu)于模型組大鼠。

2.2 AI結(jié)果

與空白組比較,模型組大鼠AI明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明造模成功;給藥第2周烏骨藤高劑量組的AI下降,與模型組及來氟米特組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);從給藥第3周開始,各治療組AI較模型組下降(P<0.05),烏骨藤組與來氟米特組療效相當。見圖1。

注:因空白組大鼠關節(jié)無腫脹,故在圖中顯示不出來;(1)與空白組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05;(3)與來氟米特組比較,P<0.05。圖1 各組大鼠AI比較Fig.1 Comparison of AI among groups

2.3 血清IL-4、IL-17A、IL-33及INF-γ水平

與空白組比較,模型組大鼠血清中IL-17A、IL-33、INF-γ表達水平升高(P<0.05);與模型組比較,烏骨藤各劑量組及來氟米特組大鼠血清IL-17A、IL-33及INF-γ表達水平降低(P<0.05),且烏骨藤高、中、低劑量組大鼠血清中IL-17A、IL-33及INF-γ水平呈劑量依耐性減少(P<0.05);與來氟米特組比較,烏骨藤高劑量組IL-17A、IL-33、INF-γ表達水平較其降低(P<0.05),烏骨藤中劑量組與其相比療效相當,差異無統(tǒng)計學意義,烏骨藤高劑量組IL-4表達水平較其明顯升高(P<0.05)。見圖2。

注:(1)與空白組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05;(3)與來氟米特組比較,P<0.05。圖2 各組大鼠血清IL-4、IL-17、IL-33及INF-γ水平比較Fig.2 Comparison of serum IL-4, IL-17, IL-33, and INF-γ levels in various groups of rats

2.4 膝關節(jié)滑膜組織sST2、ST2L、L-33基因表達

與空白組比較,模型組大鼠膝關節(jié)滑膜組織sST2、ST2L、IL-33mRNA表達明顯升高,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與模型組比較,來氟米特組和烏骨藤高劑量組sST2、IL-33、ST2L表達降低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與來氟米特組比較,烏骨藤高劑量組sST2mRNA表達降低更明顯(P<0.05)。見圖3。

注:(1)與空白組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05;(3)與來氟米特組比較,P<0.05。圖3 各組大鼠sST2、ST2L、IL-33mRNA表達Fig.3 Expression level of sST2,ST2L, and IL-33 mRNA in each group

2.5 膝關節(jié)滑膜組織sST2、ST2L、IL-33蛋白表達

與空白組比較,模型組大鼠膝關節(jié)滑膜組織sST2、ST2L、IL-33蛋白表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,來氟米特組和烏骨藤高劑量組sST2、ST2L、IL-33蛋白表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且兩組sST2、ST2L和IL-33蛋白表達水平相當。見圖4。

注:A為空白組,B為模型組,C為來氟米特組,D為烏骨藤低劑量組,E為烏骨藤中劑量組,F為烏骨藤高劑量組;(1)與空白組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。圖4 各組大鼠sST2、ST2L、IL-33蛋白表達水平比較Fig.4 Expression level of sST2,ST2L, and IL-33 proteins in each group

3 討論

RA屬于中醫(yī)學“痹癥”范疇。中醫(yī)學認為痹癥是以虛為本,以實為標之癥,其病因病機可概括為素體虛弱,氣血不足,加感風、寒、濕等外邪痹阻經(jīng)絡所致。中醫(yī)治療主要以扶正祛邪通經(jīng)、活血止痛為主[15]。藤類藥物是我國臨床中藥學重要組成部分,被廣泛應用于治療中醫(yī)痹癥。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),藤類藥物主要具有鎮(zhèn)痛、消腫和促進外周血循環(huán)等作用,主要是由其化學成分木脂素、生物堿和揮發(fā)油通過發(fā)揮抗炎、抑制血小板聚集和調(diào)節(jié)反射機制的作用[16]。烏骨藤又叫通關藤,出自《貴州民間藥物》,具有祛風除濕、通經(jīng)活血、散結(jié)消炎止痛之效,是我國西南地區(qū)常用的民族藥之一[17]。目前治療RA的中藥復方中也常見此味中藥,但對其抗炎、抗風濕作用機制鮮有報道。來氟米特是免疫抑制劑中的其中一種,對T細胞的增殖與活化具有抑制作用,可抑制相關炎性細胞因子的分泌,增強免疫抑制[18],因此本研究選用來氟米特作為陽性對照組。

研究表明,IL-33/ST2信號通路是免疫功能障礙和炎癥反應的關鍵通路[19]。ST2可調(diào)節(jié)IL-33的活性,當機體受炎癥、腫瘤、創(chuàng)傷及應激等不良因素入侵時,IL-33作為前炎癥性細胞因子分泌到細胞外,與其受體ST2結(jié)合激活下游信號,從而影響多種細胞因子及趨化因子的產(chǎn)生與分泌,導致Th1/Th2免疫應答平衡失調(diào),促使炎性反應發(fā)生發(fā)展[20-21]。T淋巴細胞上ST2的表達被證明可驅(qū)動Th2型細胞因子的產(chǎn)生,負責感染和組織修復期間的炎癥反應。ST2耗竭可導致Th1/Th17反應增強和抗腫瘤免疫[22]。IL-33與ST2L及IL-1R輔助蛋白(interleukin-1 receptor accessory protein,IL-1RAcP)結(jié)合產(chǎn)生異二聚體受體復合物,募集髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、IL-1R相關激酶1/4(interleukin-1 receptor-associated kinase1/4,IL-1RAK1/4)、TNF受體相關因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAP6),通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和活化B細胞的核子-κ輕鏈增強(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)途徑使下游轉(zhuǎn)錄因子激活[23]。ST2特異性抗體或sST2可以拮抗IL-33與ST2L受體的結(jié)合抑制下游反應。正常情況下,血清sST2含量較低。IL-33/ST2L通路的激活促進Th2的免疫炎癥反應,促進sST2表達增加,負向調(diào)節(jié)Th2反應[20]。當IL-33與特定受體ST2結(jié)合后,刺激細胞因子分泌,包括抗炎因子IL-4、IL-5、IL-13,炎癥刺激因子IFN-γ和TNF-α等增強炎癥反應,促進疾病進程的發(fā)展[24]。

本次實驗結(jié)果顯示,烏骨藤能夠下調(diào)CIA大鼠sST2、ST2L、IL-33基因及蛋白表達水平,呈劑量依耐性降低血清炎癥因子IL-17A、IL-33、INF-γ表達水平,上調(diào)抑炎因子IL-4水平,提示烏骨藤可能通過抑制調(diào)控IL-33/ST2信號,減少炎癥因子對滑膜細胞的浸潤,增加抑炎因子,降低AI,進而緩解RA的炎癥反應。烏骨藤高劑量組與RA一線用藥來氟米特對CIA模型鼠治療效果相當。本研究為RA的研究和治療提供了一定的實驗依據(jù),表明烏骨藤可能是有效治療RA的藤類藥物,值得進一步研究。