復方赤紅顆粒中獨活和川芎及芍藥苷的含量測定*

鄭小麗, 胡曉波, 鄭志昌, 李明, 楊繼紅***, 廖尚高

(1.貴州醫科大學附屬醫院 藥劑科, 貴州 貴陽 550001; 2.貴州醫科大學 藥學院, 貴州 貴陽 550001)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的、多發的、難以治愈的自身免疫性炎性關節疾病,以滑膜進行性慢性炎癥為特征[1-2]。RA的炎癥反應不僅會加重患者關節破壞、畸形及殘疾[3- 4],還會對患者心、肺、腎等重要臟器及其它系統組織造成損害,甚至死亡[5]。現代西方醫學將RA視為一種無菌性炎癥,臨床上常使用糖皮質激素、生物制劑及非甾體抗炎藥(non steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)等抗炎或鎮痛藥物進行治療[6-7],但長期使用這些西藥不僅會導致胃腸道出血、肝腎功能障礙及骨髓抑制等嚴重不良反應[8],還會增加患者中風和高血壓的風險[9]。近年來,為了解決西藥治療對人體器官的毒性、耐藥性以及降低藥物治療成本等問題,中醫藥輔助治療RA受到了廣泛關注[10-12]。復方赤紅顆粒源于本院名中醫王光義教授從獨活、川芎及赤芍等14味中藥提取制備而成,有活血化瘀、舒筋活絡及抗炎止痛等功效[13-15],廣泛應用于RA的輔助治療,不僅不會增加肝腎損害等嚴重不良反應,還能快速有效緩解患者關節疼痛、腫脹等不適。為方便使用、攜帶和儲藏,將此驗方研制成的復方赤紅顆粒,而對制劑定性鑒別和含量測定法對保證藥物的質量和療效至關重要[16- 17]。復方赤紅顆粒成分復雜,目前尚無質量標準,本研究對顆粒劑中獨活、川芎的鑒別和主要活性成分芍藥苷的含量測定進行分析,為其質量標準的建立提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1材料與主要試劑 獨活對照藥材(批號120940-200205)、川芎對照藥材(批號120918-200406)及芍藥苷對照品(批號110736-200424,含量99.5%)均購自中國食品藥品檢定研究院,復方赤紅顆粒3批(批號 20210301、20210302及20210303)、獨活及川芎陰性對照樣品均由醫院提供;甲醇是色譜純,其余試劑均是分析純,水是純化水。

1.1.2主要儀器 LC-10AT輸液泵、SPD-10A紫外檢測器、WML-2006C-4威瑪龍色譜數據工作站及HT-230A色譜柱恒溫箱(島津儀器蘇州有限公司),Ultimate 3000高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC;美國賽默飛),LIBROR AEL-160萬分之一電子天平(常熟雙杰測試儀器廠),TG332A十萬分之一分析天平(島津儀器蘇州有限公司),HS10260D超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司),硅膠G薄層板(批號G20210408,青島海洋化工有限公司),ZF-90多功能暗箱式紫外投射儀(上海顧村電光儀器廠)。

1.2 研究方法

1.2.1獨活的薄層色譜鑒別(thin layer identification,TLC) 取復方赤紅顆粒1 g研細,加甲醇溶液10 mL,超聲30 min(功率250 W,頻率40 kHz)、過濾,即得供試品溶液;另取獨活陰性樣品1 g和獨活對照藥材1 g,同法分別制得陰性對照和對照藥材溶液;分別吸取上述3種溶液各10 μL,于同一硅膠薄層板上點樣,選擇石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(7∶3)作為展開劑在層析缸中展開,取出晾干,于365 nm紫外光燈下檢視。

1.2.2川芎的TLC 取復方赤紅顆粒2 g研細,加1%鹽酸水溶液0.5 mL潤濕,加20 mL石油醚(60～90 ℃)超聲30 min(功率250 W,頻率40 kHz),濾過、揮干濾液,余下殘渣使用三氯甲烷1 mL溶解,即獲得供試品溶液;另取川芎陰性樣品2 g和川芎對照藥材0.1 g,同法分別制備陰性對照樣品和對照藥材溶液;分別吸取上述3種溶液各10 μL,于同一硅膠薄層板上點樣,選擇正己烷-乙酸乙酯(6∶1)作為展開劑在層析缸中展開,取出晾干,于302 nm紫外光燈下檢視。

1.2.3高效液相色譜(high performance liquid phase,HPLC)含量測定 溶液的制備:取芍藥苷的對照品2.09 mg,置于25 mL量瓶,加20%乙醇溶液溶解定容,得每1 mL含83.5 μg的對照品溶液;取復方赤紅顆粒3 g研細,置于100 mL錐形瓶,加20%乙醇溶液50 mL,超聲處理10 min(功率250 W,頻率40 kHz),取出,稱定質量,用20%乙醇補足減失的質量,搖勻,濾過,續濾液即為供試品溶液;按照復方赤紅顆粒處方比例制備不含赤芍的陰性對照顆粒,照上述供試品溶液同法制備陰性對照溶液;色譜條件為依利特Supersil ODS-B C18色譜柱(250 mm×4.60 mm,5 μm),甲醇-1%冰乙酸(20∶80)為流動相,檢測波長243 nm,柱溫30 ℃,流速0.90 mL/min,進樣量10 μL。

1.2.4專屬性、線性關系、精密度、穩定性及重復性測定 精密量取“1.2.3”項下對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照溶液,按該項下的色譜條件分別注入HPLC儀中,檢測專屬性;稱取芍藥苷對照品適量,加20%乙醇,制得濃度為5.22、10.44、20.88、41.76、83.52及167.04 mg/L的芍藥苷系列對照品溶液,按照“1.2.3”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積,以峰面積(Y)值為縱坐標,芍藥苷對照品濃度(Xmg/L)為橫坐標,進行線性回歸;取“1.2.3”項下對照品溶液,按該項下色譜條件進樣,連續進樣6次,記錄峰面積進行精密度評價;取“1.2.3”項下供試品溶液,放置于室溫下,分別于0、2、4、8、12及24 h按該項下色譜條件進樣,測定芍藥苷峰面積進行穩定性評價;取同一批復方赤紅顆粒(批號 20210301)6份,3.0 g/份,按“1.2.3”項下溶液制備同法配置供試品溶液,并按該項下色譜條件進樣,記錄測得的峰面積進行重復性評價。

1.2.5加樣回收試驗 取同一批復方赤紅顆粒(批號20210301),研成粉末,精密稱取9份,1.5 g/份,置于100 mL容量瓶內,編號1～9。編號1～3、4～6及7～9分別精密加167.04 mg/L芍藥苷對照品溶液10、13及15 mL,按“1.2.3”項下溶液制備中同法制備供試品溶液,并按該項下色譜條件進樣,測定峰面積并計算加樣回收率。

1.2.6樣品含量測定 分別取20210301、20210302、20210303批次復方赤紅顆粒樣品2份,3.0 g/份,按“1.2.3”項下溶液制備中同法制備供試品溶液,并按該項下色譜條件進樣,記錄峰面積并通過線性關系計算芍藥苷的含量。

1.3 統計學分析

使用Excel 2019錄入數據并計算相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。

2 結果

2.1 獨活和川芎的TLC

在獨活和川芎的TLC中,供試品與對照藥材在對應位置上均顯示相同顏色的熒光斑點,陰性無干擾。見圖1。

獨活川芎注:1為陰性樣品,2為供試品,3為對照藥材。圖1 獨活和川芎的TLCFig.1 TLC of heracleum and Ligusticum wallichii

2.2 專屬性

結果顯示,芍藥苷對照的色譜峰保留時間為23 min,供試品在相應的保留時間處有芍藥苷色譜峰且與其他峰分離良好,陰性對照在相應的保留時間處無吸收,陰性無干擾,系統適用性及專屬性均良好。見圖2。

圖2 芍藥苷的專屬性試驗結果Fig.2 Specificity test results of paeoniflorin

2.3 線性關系

芍藥苷回歸方程:Y=7.143×103X-1.101×103(r=0.999 0),結果表明芍藥苷在5.22～167.04 mg/L范圍內峰面積與對應的濃度具有良好線性關系。

2.4 精密度、穩定性及重復性

在精密度的研究中,根據測定芍藥苷峰面積計算得到芍藥苷峰面積RSD為1.14%,表明儀器精密度良好;在穩定性研究中,根據測定芍藥苷峰面積計算得到芍藥苷峰面積RSD為1.45%,表明在室溫條件下24 h內供試品溶液穩定;在重復性研究中,根據測定芍藥苷峰面積及線性關系計算得到樣品中芍藥苷平均含量為1.424 7 mg/g,RSD為1.39%,重復性符合實驗要求(表1)。

表1 復方赤紅顆粒的重復性試驗結果Tab.1 Repeatability test results of compound Chihong granules

2.5 加樣回收試驗

加樣回收率的范圍為100.4%～104.2%,平均回收率為102.8%,RSD為1.36%。見表2。

表2 復方赤紅顆粒的加樣回收試驗結果Tab.2 Sample addition recovery test results of compound Chihong granules

2.6 樣品含量測定

樣品中芍藥苷的含量測定結果顯示,批號為20210301、20210302、20210303樣品中芍藥苷平均含量分別為1.424 3 mg/g、1.409 1 mg/g及1.432 7 mg/g。見表3。

表3 樣品中芍藥苷的含量測定結果Tab.3 Determination test results of paeoniflorin in test samples

3 討論

在獨活的TLC研究中,首先考察了正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯(2∶1∶1)、石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9:2)、石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(7∶3)等不同展開劑,結果顯示以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(7∶3)為展開劑時效果最好。在川芎的TLC研究中,首先考察了石油醚(60～90 ℃)-乙醚(2∶1)、氯仿-甲醇(8∶1)、正己烷-乙酸乙酯(6:1)等不同展開劑,結果顯示以正己烷-乙酸乙酯(6∶1)為展開劑時效果最好。

在獨活和川芎這兩味君藥的TLC試驗中進一步對以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(7∶3)為獨活鑒別的展開劑、以正己烷-乙酸乙酯(6∶1)為川芎鑒別的展開劑時,在不同濕度(32%、58%及72%)、不同溫度(10 ℃、20 ℃及35 ℃)以及不同預飽和時間(10 min、20 min及30 min)下的耐受性試驗,結果顯示所建立的獨活和川芎TLC法耐用性良好,重現性好。

芍藥苷是赤芍含量最高的活性成分之一[18-19],以芍藥苷含量為評價時,首先對芍藥苷的提取體系、超聲時間及檢測波長進行篩選。結果顯示芍藥苷在乙醇濃度為20%、70%時含量最高,20%的分離度比70%的高;超聲時間為10 min時含量最高,20～50 min呈遞減趨勢,最終確定提取方法為20%乙醇超聲10 min。芍藥苷的最大吸收波長在230 nm,由于本研究中復方赤紅顆粒是中藥復方制劑,成分復雜,且不同成分間相互干擾,于230 nm處檢測赤紅顆粒樣品中芍藥苷時前后有其他成分干擾,分離度較差,經過多次摸索,選擇波長243 nm處測定芍藥苷含量,此時分離度較好,無干擾,因此選擇檢測波長為243 nm。

采用HPLC儀進行本研究中的專屬性實驗、線性關系、精密度、穩定性、重復性、加樣回收率及樣品含測,芍藥苷含量測定時對不同流動相進行了篩選,考察了以甲醇∶水(15∶85)、甲醇∶1%冰乙酸(17∶83)和甲醇∶1%冰乙酸(13∶87)和甲醇∶1%冰乙酸(20∶80)體系,發現當以前3者為流動相時芍藥苷出峰時間太長或不出峰且雜質峰干擾大,而甲醇∶1%冰乙酸(20∶80)為流動相時獲得的分離效果最好且陰性無干擾,最后確定甲醇∶1%冰乙酸(20∶80)為含量測定的流動相。

另外,本研究進一步考察了流速(0.88 mL/min、0.90 mL/min及0.92 mL/min)、流動相比例[甲醇∶1%冰乙酸(22∶78)、甲醇∶1%冰乙酸(20∶80)及甲醇∶1%冰乙酸(18∶82)]、柱溫(28 ℃、30 ℃及32 ℃)以及檢測波長(241 nm、243 nm及245 nm)的微小變化對分離效果及含量測定的影響,結果顯示系統微小變化不影響復方赤紅顆粒中芍藥苷的含量測定。此外,使用液相色譜儀進行了中間精密度的考察,結果顯示RSD為1.37%(<2%),表明中間精密度良好。

獨活和川芎具有祛風除濕、活血行氣及通痹止痛的功效[20-21],在驗方中均屬于君藥;芍藥苷可通過減少炎癥介質的產生可發揮抗炎和免疫調節作用[22-24],也是治療RA的主要活性成分[25-26]。本研究所建立的獨活、川芎兩味君藥的TLC法專屬性高,建立的芍藥苷含量測定法專屬性好、分離度高及重現性好,可用于復方赤紅顆粒的質量控制,為后期開發為醫院制劑提供數據支撐。