畜禽養殖場氣載抗性基因污染特征與技術挑戰

王燦，張媛，宋璐*

（1.天津大學環境科學與工程學院，天津 300350；2.天津市室內環境空氣質量控制重點實驗室，天津 300072）

近年來，由于抗生素可以高效預防和治療由細菌、真菌和原生動物等引起的感染而被廣泛使用[1]。但抗生素的使用誘導細菌產生了使抗生素藥物失效的抗生素抗性基因（ARGs）。調查表明，全球超過70%的抗生素都被用于畜禽養殖[2]。抗生素在動物體內只有少部分被吸收代謝，其余30%~90%通過排泄物進入環境中[3]，這為環境中耐藥細菌（ARB）的產生提供了更大的選擇優勢。有研究表明，養殖場內動物糞便中的微生物容易氣溶膠化，進而可以向外排放[4-5]，而懸浮在空氣中的微生物氣溶膠和細顆粒物是攜帶ARGs 從牲畜向人類傳播的主要途徑之一[6-7]。人畜共患病抗性病原體在新出現的傳染病事件中起到關鍵作用[8]，近年來動物源病原體在空中傳播引起的人類健康危機受到了廣泛關注[9-10]，因此有必要研究畜禽養殖場中ARGs 及ARB 的空氣傳播途徑。在此基礎上，本研究針對畜禽養殖場中抗生素的使用及氣載ARGs相關研究和公告做了調查，結果見圖1。

圖1 畜禽養殖場中抗生素的使用及氣載ARGs的研究進展Figure 1 Development of antibiotics and airborne ARGs in livestock farms

目前人們對于水和土壤環境中ARGs 的賦存規律及歸趨特性已經進行了較為深入的研究[11-13]，但對于氣載ARGs 的關注較少。同時，由于空氣與其他介質不同，空氣中的傳質阻力更小、擴散性更強，而且機理更為復雜，影響可能更大。因此，本文討論總結了畜禽養殖場中氣載ARGs 的污染現狀與傳播轉移特點，探究了畜禽養殖場中氣載抗性基因傳播的影響因素和對人體產生的健康風險，為今后畜禽養殖場生態風險和人體健康風險管控提供參考。

1 畜禽養殖場中氣載ARGs的污染現狀

氣載ARGs 的采集方法通常可以按照其采集原理劃分為撞擊式采樣法、氣旋式采樣法、靜電式采樣法和過濾式采樣法，ARGs 常見的分析方法有PCR、qPCR、HT-qPCR、ddPCR、宏基因組學或多種方法的組合，采集及檢測方法的選擇對于最終的檢測結果和效率有著重要的影響。近年來，越來越多的研究在畜禽養殖場空氣環境中檢出ARGs[14-23]（表1）。在養豬場空氣環境中，Liu 等[24]研究發現94%的菌株對磺胺甲惡唑具有耐藥性，有3 種菌株對9 種抗生素具有耐藥性，并發現攜帶ARGs 的金黃色葡萄球菌形成的氣溶膠已擴散到養殖場外的環境中。Chen等[25]在豬場、牛場、蛋雞舍、肉雞舍內空氣中均發現了大量的ARB。畜禽養殖場空氣中的ARGs 及ARB 主要來源于動物糞便，糞便中的ARGs 及ARB 隨著糞便處理和動物移動很容易被氣溶膠化[26]。但有研究發現，某些ARGs 如mexF 在氣溶膠中的相對豐度高于在糞便中的，這表明氣溶膠中的ARGs也可能存在其他來源[27]。

表1 典型畜禽養殖場中氣載ARGs的檢出Table 1 Detection of airborne ARGs in the livestock farms

通過查閱文獻，將“空氣”“氣載”“氣溶膠”“大氣”“抗性 基 因”“抗性”“抗 菌”“抗 生素”“養 殖 場”“雞 場”“豬場”“牛場”“畜禽”中不同屬性的關鍵詞進行組合，在中國知網數據庫進行檢索，將“air”“airborne”“airborne”“bioaerosol”“atmosphere”“antimicrobial”“antibi-otic”“anti-bacterial”“antibiotic resistance”“resist”“an-tibiotic”“farm”“chicken farm”“pig farm”“livestock and poultry”中不同屬性的關鍵詞進行組合，在Web of Sci-ence 中檢索近5 年的文獻，并刪除不相關文章，對相關文獻中國內外典型畜禽養殖場氣載ARGs 檢出頻次與濃度范圍進行整理總結，見圖2。如圖2a 所示，關于養雞場中氣載ARGs 的研究較多，且集中于四環素類ARGs。四環素是一類廣譜抑菌藥物，因其價格低廉且高效的優勢在畜禽養殖中有較高使用頻率[2]，據調查我國2013 年用于畜禽養殖行業的四環素總量為5 780 t，其中1 130 t 用于養雞場[28]。在選擇壓力下，許多細菌對四環素類抗生素產生耐藥性，且這些細菌廣泛存在于各類畜禽養殖場空氣環境中。除此以外，四環素類、磺胺類、β-內酰胺類、MLSB 類ARGs在畜禽養殖場空氣環境中均有較高檢出濃度，最高可達108copies·m-3（圖2b）。值得注意的是，萬古霉素類ARGs 雖然檢出濃度較低，但其是在所有抗生素均失效的情況下用來治療嚴重感染的抗生素，被認為是“最后一線藥物”，這表明畜禽養殖場空氣環境中存在的抗生素健康風險不容小覷。

圖2 典型畜禽養殖場中氣載ARGs檢出頻率及濃度范圍Figure 2 Detection frequency and concentration range of airborne ARGs in the environment of livestock farms

2 畜禽養殖場中氣載ARGs的傳播

畜禽養殖場中ARGs 分布廣泛，對環境和人體健康都存在威脅，其中氣載ARGs 潛在的在宏觀環境中的傳播擴散途徑如圖3 所示。研究表明，畜禽養殖場氣載ARGs 來源廣泛，其中糞便是氣載ARGs 的主要來源之一[14]。由于空氣動力學的性質，空氣傳播的ARGs 可能會由于天氣事件的驅動而進行長距離運輸。通過對雞場和奶牛場的氣溶膠及周圍空氣進行研究并建立大氣擴散模型，發現空氣中的ARGs 可以沿風向從畜禽養殖場分散到10 km 的距離[17]。另一項研究表明，來自養殖場的細菌可能導致周圍半徑3 km 內的居民暴露[29]。同時，相對于水和土壤中的ARGs，氣載ARGs 傳播更迅速，傳播距離更遠，而且比較容易被人體吸入，因此可能更直接地對人體造成危害。

圖3 畜禽養殖場中ARGs的傳播擴散示意圖Figure 3 Schematic diagram of ARGs spread in livestock farms

與此同時，畜禽養殖場中的ARGs 可以是內源抗性（即自身固有），即可以通過誘變因素誘導而自發突變，還可以通過基因的遷移轉化獲得[30-31]。其中基因的遷移轉化機制包括垂直轉移（VGT）和水平轉移（HGT）（圖4）。HGT 是通過可移動的載體將ARGs 從供體菌轉移到受體菌的過程，具體的方式有接合、轉化、轉導等（圖4）[32]。在接合過程中，質粒、轉座子、整合子、插入序列、插入序列共同區元件、基因組島和整合接合元件等可移動基因元件（MGEs）通過接合菌毛由供體細胞轉移到受體細胞[33]。轉化是處于感受態的細菌吸收并整合環境中存在的DNA 的過程[34]。轉導是將外源宿主遺傳物質整合到噬菌體中，噬菌體通過捕食來傳遞遺傳物質的過程[35]。畜禽養殖場是易感細菌產生耐藥性并傳播的重要場所。研究發現，豬場室內氣載ARGs 在冬季時的主要傳播方式是HGT[14]。對于具有耐藥性的氣載病原體，ARGs 在空氣環境中的HGT 可能對人體健康造成很大的風險。VGT 是指攜帶ARGs 的菌株通過繁殖進行的親代和子代的基因傳遞。VGT 也可以發生在HGT 的情況之下，即由HGT 形成的轉導接合物可以通過次級HGT和細胞生長進一步促進ARGs的傳播[36]。由于在自然環境中，HGT 與VGT 共存，在研究中我們需要區分VGT 和HGT，從而了解這兩種重要轉移途徑的機制，進而深入分析ARGs總體傳播的影響因素。

圖4 ARGs在微生物之間的轉移Figure 4 Transmission of ARGs between microorganisms

3 畜禽養殖場中影響氣載ARGs 傳播的主要因素

3.1 抗生素

抗生素作為預防和促生長添加劑被廣泛添加到畜禽飼料中[37]。抗生素的影響主要包括消化系統異常、超敏反應、毒性作用以及抗生素耐藥細菌的產生和傳播。研究表明，畜禽養殖中添加的抗生素經畜禽消化吸收后，會在體內誘導產生大量的ARGs，這些ARGs 可通過呼吸或排泄物進入環境中[38]。排泄物中的ARGs 不僅會污染周圍的水和土壤生態系統，還會向大氣環境逸散傳播[14]。Song 等[39]研究發現使用抗生素的雞場中氣載ARGs 的濃度比未使用抗生素的雞場高約2個數量級，并且添加抗生素時發生HGT的可能性也較高。研究表明，實行抗生素藥物管理制度可以成功減少耐藥性，例如美國通過有機飼料喂養使得養雞場的多重耐藥率從84%下降至17%[40]。因此，限制動物養殖中抗生素的添加是控制環境中ARGs的直接途徑[41]。

3.2 細菌群落

細菌作為各種ARGs 的宿主菌，除了可以用來評估對人類的健康風險外，還可以為ARGs 的傳播提供針對性信息。細菌群落的變化會影響ARGs 的豐度和多樣性。Mantel 試驗表明，ARGs 與細菌群落組成密切相關，表明細菌群落結構的變化是影響ARGs 變化的重要因素，同時該研究通過方差分解分析確定了細菌群落占ARGs變化總量的27.6%，在ARGs的傳播過程中起了關鍵作用[42]。值得注意的是，一些導致人畜共患病的條件致病菌（如Kocuria、Staphylococcus、Escherichia和Pseudomonas）與ARGs 顯著相關，表明這些屬可能會改變生物氣溶膠中ARGs 的結構，并且Ruminococcus與多種ARGs 均呈正相關，說明其可能具有多重耐藥性[43]。我們需要進一步研究畜禽養殖場中氣載ARGs 的宿主，以建立更有效的方法來控制ARGs的傳播。

3.3 基因可轉移元件

整合子、轉座子及質粒等MGEs 是ARGs 發生HGT 的重要載體。既往研究已經建立了MGEs 與ARGs 之間的共現模式和顯著相關性，ARGs 與MGEs共現率較高時ARGs 有較大的可能發生HGT，HGT 能夠加快ARGs 的傳播和繁殖[44]。如在養豬場中，冬季空氣樣本中的目標ARGs 與MGEs 的共現率較夏季更高，其中轉座子IS613與整合子intl1幾乎與所有ARGs顯著相關（P<0.05），并且氣載ARGs 濃度分布結果表明，冬季氣載ARGs的平均濃度顯著高于夏季[14]。

3.4 環境因素

溫度和濕度等物理因素都在生物氣溶膠的發生、遷移、沉積中起著重要的作用。溫度影響微生物在空氣中的存活時間，進而可改變微生物的群落結構[45-46]。微生物群落的豐度和種類隨溫度變化，從而會影響其ARGs攜帶能力[47]。由于水分會增加生物氣溶膠的粒徑而增強沉積，因此濕度較大時大氣中微生物的豐度會降低，從而導致氣載ARGs 的減少。同時，潮濕環境使得土壤或糞便中微生物氣溶膠化變得更加困難，在一定程度上將會降低空氣中微生物群落的豐度，從而影響氣載ARGs 的賦存[48]。Song 等[14]發現濕度對豬場空氣中宿主菌和ARGs/MGEs 均有負面影響。此外，畜禽養殖場中積累的排泄物和殘留的飼料釋放的氣溶膠很容易吸附空氣中的微生物和氨、硫化氫等污染物[49]，一方面，這些污染物作為營養物質，可以為一些細菌的生長和代謝提供能量；另一方面，它們可能對細菌有毒性作用[50]，進而影響ARGs 的賦存。除此以外，PM2.5作為細菌生長的載體也會影響氣載ARGs 的分布。因此，不同環境因素對氣載ARGs的影響機制研究將為養殖條件的管理提供理論指導。

4 畜禽養殖場中氣載ARGs的健康風險

由ARB 引起的感染比由敏感微生物引起的感染更容易引起高死亡率[11]。預計到2050 年，與ARB 相關的人類感染將導致全球約1 000萬人死亡[51]。抗生素耐藥性的健康風險主要有兩方面：第一，由耐藥菌引起的人體感染使得疾病治療難度加大；第二，HGT使其他菌落尤其是致病菌產生耐藥性，增加了感染的風險。因此根據發生、暴露等數據定量評估ARGs 與ARB的人類健康風險尤為重要。

通過分析特定的ARGs與ARB的濃度計算暴露劑量和劑量反應關系，可以評估ARGs 與ARB 的健康風險[11]。暴露劑量（copies·kg-1·d-1）是指人類個體單位體質量每日接觸到ARGs 的劑量。Wang 等[52]研究發現，在衛生間和普通室外空氣環境中，通過呼吸途徑暴露于ARGs 的劑量（102~104copies·kg-1·d-1）略低于通過食物攝入的劑量（103~105copies·kg-1·d-1），但高于通過飲用水攝入的劑量（101~105copies·kg-1·d-1），特別是通過空氣吸入的blaTEM-1比通過飲用水的暴露劑量高出兩個數量級（圖5）。與城市或城市固體廢物處理系統中的空氣相比[53-55]，畜禽養殖場中存在更多的氣載ARGs，因此造成的人類暴露風險更高[56]。如與暴露于城市固體廢物處理場的工人相比[54]，養殖場中的工人吸入的qnrA和qnrS更多[57]。因此，畜禽養殖場成為了對人類具有較大健康風險的場所。

圖5 ARGs通過食物、飲用水、接觸和呼吸途徑的暴露劑量Figure 5 Exposure dose rate of ARGs through food intake，drinking water，skin and the respiratory route

5 挑戰與展望

我國在畜禽養殖行業使用的大量抗生素造成了嚴重的ARGs 污染，但對于畜禽養殖場氣溶膠中的ARGs 的研究較少，且仍處于起步階段。本文對畜禽養殖場中氣載ARGs 進行了綜合闡述，包括其性質、行為、傳播和人類健康風險。結果表明在畜禽養殖場空氣中存在多種類、高濃度的ARGs，其中氣載ARGs的發生和傳播方式受到抗生素使用、細菌群落、MGEs和環境條件等多種因素影響，具有較高的人體健康暴露風險，因此本文對未來開展相關的研究提出以下幾點建議：

（1）優化氣載ARGs的采集與檢測方法

氣載ARGs 與水和土壤中的ARGs 不同，空氣中可收集顆粒物的可用性有限，采集的樣本生物量低，導致空氣中的ARGs 不能直接分析和檢測。在樣本采集方面，固體撞擊采樣法會使樣品增殖，從而無法準確定量ARGs 濃度；液體撞擊采樣法僅用于短時間的空氣樣品采集，由于采樣時間短、樣品生物量低而不能監測空氣中較低濃度的ARGs。而過濾式采樣法能在一定程度上解決培養法定量難的問題，且通過延長采樣時間能夠實現低濃度空氣中ARGs 的富集，減小撞擊采樣法造成的樣品損失。現階段研究對于ARGs 的檢測手段存在缺陷。由于ARGs 引物的可用性有限，較多基于PCR 及qPCR 的檢測方法只能集中于少數類型的ARGs 亞型，此外，常規PCR 及qPCR 的低通量和擴增偏差，使實際畜禽養殖場中氣載ARGs的完整性及綜合性分析具有挑戰性。

（2）探究畜禽養殖場中氣載ARGs 的傳播機制與健康風險

一些人為和生物物理過程影響和控制了氣載ARGs 的傳播和轉移。結合空氣動力學特征，畜禽養殖場中氣載ARGs 可能在場外廣泛傳播，從而造成較大的生態健康風險。全面了解這些人為和環境影響因素對于制定保障人類健康及緩解畜禽養殖行業耐藥性戰略至關重要。然而，目前關于氣載ARGs 和ARB 在畜禽養殖場及周圍環境的生物氣溶膠中傳播和轉移的研究過于簡單化，對許多方面仍然知之甚少，包括：耐藥菌和非耐藥菌之間耐藥性轉移的可能性和機制；生物氣溶膠在沉積過程中ARGs 和ARB 的環境行為和持久性；生物氣溶膠的降解過程、人體健康暴露和健康風險研究。因此需要進一步深入研究，清晰了解各種因素之間的互作關系，從而減緩畜禽養殖場中氣載ARGs的產生與傳播。

（3）評估“禁抗令”對畜禽養殖場中耐藥性的影響

我國于2017 年出臺了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃》，打擊飼料生產企業違規添加行為；2019年7月發布了第194號公告，停止生產、進口、經營、使用部分抗生素作為飼料添加劑。在我國已經全面開展“禁抗令”行動的背景下，畜禽養殖場中仍存在耐藥性問題。目前，針對“禁抗令”對畜禽養殖場中氣載ARGs 及ARB 影響的相關研究較少，且由于養殖方式、養殖規模、“禁抗令”前后抗生素藥物添加的劑量、種類等不盡相同，“禁抗令”產生的影響也有所差異，現有研究缺少對“禁抗令”實施后畜禽養殖場所耐藥性的全面評估，因此有待進行深入研究，以期為畜禽養殖行業的科學發展提供理論依據。