不同鎘耐受性香菇子實(shí)體對(duì)鎘脅迫的生理響應(yīng)

翟丹丹，閆苗苗，姜寧，李巧珍，尚曉冬，譚琦，李玉，于海龍*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，長(zhǎng)春 130118；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 201403）

香菇（Lentinula edodes）是我國(guó)第一大食用菌品種，其產(chǎn)量占我國(guó)食用菌總產(chǎn)量的31%以上，其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛[1]。重金屬可以通過生物富集進(jìn)入人體[2]，對(duì)人體造成一定的毒性損傷[3]。食用菌具有重金屬富集特性最早是由Stijve等[4]報(bào)道，后續(xù)又有大量的研究報(bào)道證實(shí)很多大型真菌都具有重金屬富集特性[5-6]，且其富集程度大于植物[7]。研究發(fā)現(xiàn)，不同種類間、同一種類不同品種間、同種內(nèi)不同菌株間、同一個(gè)體不同部位間的重金屬富集程度和含量都有差異[8-9]。前期研究表明，香菇子實(shí)體中鎘含量存在超標(biāo)現(xiàn)象，栽培區(qū)域、基質(zhì)、品種、栽培方式等生產(chǎn)因素都會(huì)對(duì)香菇中鎘含量產(chǎn)生影響[10]，不同潮次、不同部位、不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的香菇子實(shí)體中的鎘含量也會(huì)有顯著差異[11-12]。在對(duì)靈芝[13]、猴頭菇[14-15]、香菇[16-17]的研究中證實(shí)，食用菌生長(zhǎng)發(fā)育過程中的活性物質(zhì)累積是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，當(dāng)生物體受到脅迫時(shí)，其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如可溶性蛋白等的含量會(huì)發(fā)生顯著變化，以維持細(xì)胞正常代謝[18]，而丙二醛（MDA）是衡量非生物脅迫后細(xì)胞氧化損傷程度的重要指標(biāo)[19]，探究鎘脅迫對(duì)香菇菌株不同生長(zhǎng)發(fā)育階段鎘含量及活性物質(zhì)積累的影響，可以進(jìn)一步了解香菇子實(shí)體內(nèi)鎘積累的生理機(jī)制。前期本課題組以菌絲生長(zhǎng)速率和鎘含量為指標(biāo)對(duì)99份香菇種質(zhì)資源進(jìn)行鎘耐受性評(píng)價(jià)，獲得了不同鎘耐受性的香菇菌株和外源鎘脅迫下的表型差異[20]。本研究以4606（鎘積累較低）和4625（鎘積累較高）兩個(gè)不同鎘耐受性香菇菌株為供試菌株[21]，通過外源添加鎘脅迫，探究?jī)蓚€(gè)菌株不同發(fā)育階段子實(shí)體中鎘含量、MDA含量、可溶性蛋白含量的變化規(guī)律，明確不同鎘耐受性香菇菌株在不同發(fā)育階段對(duì)鎘脅迫的生理響應(yīng)差異，以期為闡明不同鎘耐受性香菇菌株鎘脅迫應(yīng)答提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

香菇菌株4606（國(guó)品認(rèn)菌2007004）和4625（國(guó)品認(rèn)菌2008007），由國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心提供。

PDA 培養(yǎng)基（購(gòu)自美國(guó)BD 公司）：將PDA 培養(yǎng)基按照說明書中的方法進(jìn)行配制，將配制好的培養(yǎng)基于121 ℃高壓滅菌30 min。

原種及栽培種培養(yǎng)料配方：櫟木屑79%、麥麩20%、石膏1%，含水量57%~58%，pH自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌袋制作及培養(yǎng)

無鎘添加的對(duì)照組栽培種培養(yǎng)料按照1.1中的配方配制。鎘添加的培養(yǎng)料按照每千克培養(yǎng)料添加500μL氯化鎘母液（10 g·L-1）的比例配制。培養(yǎng)料混勻后測(cè)定接種前單位干質(zhì)量培養(yǎng)料中的實(shí)際鎘含量，其中對(duì)照組為（0.386±0.059）mg·kg-1、處理組為（6.918±0.484）mg·kg-1。稱取1 kg培養(yǎng)料裝入聚丙烯袋，并保持裝料高度一致，封口后121 ℃高壓滅菌4 h，料溫降到28 ℃以下接種，接種量為3%（體積比），接種后將菌棒放入培養(yǎng)室（23±1）℃避光培養(yǎng)，菌棒中心溫度不超過26 ℃，空氣相對(duì)濕度60%~80%；待菌棒發(fā)滿菌后，調(diào)控溫度、濕度、光照及通氣等條件促進(jìn)轉(zhuǎn)色：溫度（23±1）℃，空氣相對(duì)濕度60%~80%，光照強(qiáng)度50~200 lx，每天光照時(shí)長(zhǎng)不少于12 h。

1.2.2 出菇管理

接種后150 d 進(jìn)行出菇處理，將菌棒置于環(huán)境參數(shù)可控的出菇房，設(shè)置（12±1）℃進(jìn)行催蕾，48 h 后菇房溫度設(shè)置為（17±1）℃進(jìn)行出菇，空氣相對(duì)濕度85%~95%，光照強(qiáng)度100~200 lx，出菇管理過程中不疏蕾。

1.2.3 子實(shí)體農(nóng)藝性狀測(cè)定

每個(gè)處理取12個(gè)菌棒，每3個(gè)菌棒為一次生物重復(fù)，測(cè)定香菇子實(shí)體農(nóng)藝性狀。

1.2.4 MDA含量及可溶性蛋白含量測(cè)定

將香菇子實(shí)體發(fā)育分為原基期、生長(zhǎng)期、成熟期、開傘期4 個(gè)階段，每個(gè)時(shí)期3 個(gè)重復(fù)菌棒，按照?qǐng)D1 所示收集4 個(gè)時(shí)期子實(shí)體樣品，樣品經(jīng)液氮速凍并研磨后，稱取0.1 g 于2 mL 離心管，并于-80 ℃超低溫冰箱保存。使用MDA 試劑盒測(cè)定MDA 含量，使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量試劑盒測(cè)定可溶性蛋白含量，兩種試劑盒均購(gòu)自蘇州科銘生物有限公司。

圖1 香菇子實(shí)體不同生長(zhǎng)發(fā)育階段示意圖Figure 1 Schematic diagram of different growth and development stages of Lentinula edodes fruiting bodies

1.2.5 鎘含量測(cè)定

隨機(jī)選取對(duì)照及鎘添加的未接種培養(yǎng)料各5 棒，以及出菇后不同發(fā)育階段子實(shí)體樣品，置于50 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，粉碎研磨，過80 目篩，于干燥處保存?zhèn)溆谩⒄誈B 5009.15—2014[22]的方法測(cè)定培養(yǎng)料與香菇子實(shí)體中單位干質(zhì)量的鎘含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用SPSS 23.0[23]進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（Duncan，P<0.05）及相關(guān)性分析（Pearson）。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)子實(shí)體農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的影響

鎘脅迫對(duì)不同鎘耐受性菌株的主要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量變化有不同影響（表1）：菌株4606受到鎘脅迫后菌蓋直徑和菌蓋厚度顯著降低，其余農(nóng)藝性狀未受到顯著影響；菌株4625 受到鎘脅迫后單棒子實(shí)體個(gè)數(shù)、單棒產(chǎn)量顯著降低，單菇質(zhì)量、菌蓋質(zhì)量顯著升高，其余農(nóng)藝性狀未受到顯著影響。鎘脅迫對(duì)菌株4625 的主要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量的影響更大。

表1 鎘脅迫對(duì)香菇子實(shí)體農(nóng)藝性狀的影響Table 1 Effects of Cd stress on agronomic characters of Lentinula edodes fruiting bodies

2.2 對(duì)子實(shí)體不同發(fā)育階段鎘含量的影響

對(duì)鎘脅迫后不同鎘耐受性香菇子實(shí)體不同發(fā)育階段中鎘含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果如圖2。外源添加鎘脅迫后菌株4606 各生長(zhǎng)階段的鎘含量分別為原基期（68.817±4.479）mg·kg-1、生長(zhǎng)期（69.760±6.114）mg·kg-1、成熟期（53.667±8.791）mg·kg-1、開傘期（45.170±8.205）mg·kg-1，菌株4625 分別為原基期（128.900±14.465）mg·kg-1、生長(zhǎng)期（95.573±1.406）mg·kg-1、成熟期（79.580±1.456）mg·kg-1、開傘期（60.950±1.291）mg·kg-1。菌株4625 的4 個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段子實(shí)體中鎘含量均表現(xiàn)為：原基期>生長(zhǎng)期>成熟期>開傘期；菌株4606的原基期與生長(zhǎng)期無顯著差異，成熟期與開傘期的鎘含量顯著低于原基期與生長(zhǎng)期。結(jié)果說明子實(shí)體中鎘含量隨著子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，有逐步降低的趨勢(shì)。對(duì)鎘脅迫后兩個(gè)菌株不同生長(zhǎng)發(fā)育階段中的鎘含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，受到鎘脅迫后，菌株4625在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的鎘含量均遠(yuǎn)高于菌株4606，其中原基期的差異倍數(shù)最大，為菌株4606原基期的1.873倍，說明菌株4625更容易吸收培養(yǎng)料中的鎘。

圖2 鎘脅迫對(duì)香菇不同發(fā)育階段子實(shí)體鎘含量的影響Figure 2 Effects of Cd stress on Cd content in fruiting bodies of Lentinula edodes at different developmental stages

2.3 對(duì)子實(shí)體MDA含量的影響

鎘脅迫對(duì)子實(shí)體MDA 含量的影響見圖3。菌株4606對(duì)照組MDA含量隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先顯著降低后顯著升高，生長(zhǎng)期MDA 含量顯著低于其他發(fā)育階段，鎘脅迫處理后菌株4606 的MDA 含量先上升后顯著降低，生長(zhǎng)期MDA 含量最高，為（8.967±1.149）nmol·g-1；將相同生長(zhǎng)發(fā)育階段鎘脅迫前后子實(shí)體MDA 含量進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)鎘脅迫前后原基期MDA 含量無顯著差異，生長(zhǎng)期MDA 含量在鎘脅迫后顯著升高，且高于對(duì)照組1.249 nmol·g-1，成熟期MDA 含量在鎘脅迫后顯著下降，且低于對(duì)照組0.629 nmol·g-1，開傘期MDA含量在鎘脅迫后極顯著降低，且低于對(duì)照組1.066 nmol·g-1。菌株4625對(duì)照組MDA含量隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先顯著降低后顯著升高，成熟期MDA含量最低，鎘脅迫處理后菌株4625 的MDA 含量隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)顯著降低，成熟期MDA 含量最低；將相同生長(zhǎng)發(fā)育階段鎘脅迫前后子實(shí)體MDA含量進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)鎘脅迫前后原基期、生長(zhǎng)期、成熟期MDA 含量無顯著差異，開傘期MDA 含量在鎘脅迫后顯著降低，且低于對(duì)照組1.720 nmol·g-1。

圖3 鎘脅迫對(duì)不同階段香菇子實(shí)體MDA含量的影響Figure 3 Effects of MDA content in the fruiting bodies of Lentinula edodes at different stages under Cd stress

2.4 對(duì)子實(shí)體中可溶性蛋白含量的影響

測(cè)定不同階段香菇子實(shí)體中可溶性蛋白含量發(fā)現(xiàn)（圖4），菌株4606對(duì)照組與鎘脅迫組的可溶性蛋白含量均隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降，而菌株4625 對(duì)照組與鎘脅迫組不同發(fā)育階段可溶性蛋白含量均隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)先顯著升高后顯著降低，生長(zhǎng)期可溶性蛋白含量最高，開傘期可溶性蛋白含量最低。將相同生長(zhǎng)發(fā)育階段鎘脅迫前后子實(shí)體中可溶性蛋白含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)鎘脅迫導(dǎo)致菌株4606 子實(shí)體開傘期可溶性蛋白含量顯著降低，而菌株4625 原基期、生長(zhǎng)期、開傘期子實(shí)體可溶性蛋白含量極顯著升高。

圖4 鎘脅迫對(duì)不同階段香菇子實(shí)體可溶性蛋白含量的影響Figure 4 Effects of soluble protein content of Lentinula edodes fruiting bodies under Cd stress at different stages

3 討論

重金屬污染是被廣泛關(guān)注的世界性問題，且重金屬屬于非氧化還原金屬，其不僅會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，還可能通過食物鏈進(jìn)入人體而威脅人體健康，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)造成重金屬中毒。有研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫下姬松茸子實(shí)體數(shù)量顯著減少[24]，平菇子實(shí)體的產(chǎn)量降低[25]，杏鮑菇子實(shí)體產(chǎn)量及生物學(xué)效率降低[26]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鎘脅迫造成菌株4625 單棒子實(shí)體個(gè)數(shù)、單棒產(chǎn)量顯著低于對(duì)照，但菌株4606 受到鎘脅迫后的菌蓋直徑、菌蓋厚度顯著降低，其余農(nóng)藝性狀未受到顯著影響。劉朋虎等[27-28]以兩個(gè)不同鎘耐受性姬松茸菌株為材料進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)外源鎘添加對(duì)兩菌株子實(shí)體農(nóng)藝性狀產(chǎn)生的影響各異，且該影響與外源添加的鎘濃度相關(guān)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鎘脅迫對(duì)兩個(gè)不同鎘耐受性香菇菌株的農(nóng)藝性狀也產(chǎn)生不同影響，這可能與前期課題研究證實(shí)的菌株4625和菌株4606對(duì)鎘脅迫表現(xiàn)出不同的應(yīng)答模式有關(guān)[21]。生物體在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力不同[29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)不同鎘耐受性香菇菌株子實(shí)體中鎘含量均有隨著子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低的趨勢(shì)，這與吳陽[30]的研究結(jié)果一致。受到鎘脅迫后，菌株4625在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的鎘含量均遠(yuǎn)高于菌株4606，說明相比于菌株4606，菌株4625 更容易吸收培養(yǎng)料中的鎘。

MDA 含量是細(xì)胞膜脂過氧化的檢驗(yàn)指標(biāo)，間接表示細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損害程度，其含量越高說明受到的傷害越重。正常情況下，生物體的MDA 含量很低，但受到脅迫后，MDA 的變化可以反映菌株的脂質(zhì)過氧化程度，間接反映菌株的抗脅迫能力。董洪新等[31]發(fā)現(xiàn)豬肚菇子實(shí)體未生長(zhǎng)成熟前其子實(shí)體內(nèi)SOD 和CAT 具有較高的活性氧清除能力，MDA 含量水平較低。鎘脅迫菌株4606 幼菇期的MDA 含量顯著高于對(duì)照組幼菇期，這可能是因?yàn)榫?606 子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育前期還未形成完備的抗性系統(tǒng)，鎘脅迫導(dǎo)致菌株4606胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷；鎘脅迫下，菌株4606成熟期、開傘期的MDA 含量以及菌株4625開傘期的MDA含量顯著低于對(duì)照組相應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育階段，這可能是后期胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)被誘導(dǎo)，在一定程度上削弱了鎘脅迫造成的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化[32]。魏杰等[33]在研究鹽脅迫對(duì)西藏?cái)M溞MDA 影響的過程中也發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫下的MDA 含量均低于對(duì)照組，且隨著鹽脅迫濃度的升高，部分抗氧化酶活性增強(qiáng)，機(jī)體的滲透調(diào)節(jié)功能加強(qiáng)，從而可清除代謝過程中產(chǎn)生的自由基，進(jìn)而減少機(jī)體氧化損傷。因此，我們推測(cè)本試驗(yàn)部分發(fā)育階段MDA 含量顯著低于對(duì)照可能也是受到菌株內(nèi)抗氧化酶系及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鎘脅迫處理后菌株4606 不同發(fā)育階段的MDA 含量相比于對(duì)照組先上升后顯著降低，而鎘脅迫處理后菌株4625原基期、生長(zhǎng)期、成熟期的MDA 含量未受到顯著影響，但鎘脅迫后開傘期MDA 含量相比于對(duì)照組顯著降低，且鎘脅迫處理后菌株4625 開傘期MDA 含量（1.720 nmol·g-1）的下降程度高于菌株4606（1.066 nmol·g-1），整體上，相比于菌株4606，鎘脅迫處理對(duì)菌株4625氧化損傷的程度更低。結(jié)合菌株4625受到鎘脅迫的產(chǎn)量性狀來看，雖然鎘脅迫下菌株4625 開傘期MDA 含量顯著低于對(duì)照組，但菌株4625 的農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量受鎘脅迫影響較大，這可能是由于生物體受到脅迫時(shí)會(huì)主動(dòng)調(diào)整生長(zhǎng)發(fā)育與脅迫適應(yīng)之間的關(guān)系來應(yīng)對(duì)脅迫[34]。Carpenter 等[35]的研究發(fā)現(xiàn)部分生物在遇到某些逆境時(shí)會(huì)選擇延遲或減少生殖生長(zhǎng)，推測(cè)這可能是生物體內(nèi)泛素化蛋白酶體失活，無法清除體內(nèi)的錯(cuò)誤折疊或變性蛋白而導(dǎo)致生育受阻造成的[36]。

可溶性蛋白是重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)性物質(zhì)，可對(duì)外界刺激迅速反應(yīng)，是有機(jī)體合成代謝及分解的指示劑[37]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株4606 的可溶性蛋白含量均隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降，這與王東明等[38]的研究結(jié)果一致。宋鵬等[39]發(fā)現(xiàn)鎘脅迫條件下雙孢蘑菇抗氧化酶和可溶性蛋白含量受鎘脅迫時(shí)間的影響，菌株4606 的代謝水平隨生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，菌株4625 的可溶性蛋白含量隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)先顯著升高后顯著降低，可溶性蛋白作為研究酶活的重要指標(biāo)，間接反映出菌株4625 的總體代謝水平隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)先顯著升高后顯著降低，這也與MDA 含量變化趨勢(shì)相互印證。菌株4625 在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的鎘含量均遠(yuǎn)高于菌株4606，這可能是菌體中特定成分可溶性蛋白和協(xié)同抗氧化酶系的共同作用，增強(qiáng)了菌株對(duì)外源鎘的耐受性[40]。

4 結(jié)論

（1）兩個(gè)不同鎘耐受性香菇菌株受到鎘脅迫后，其子實(shí)體農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量都受到影響，但不同菌株受鎘脅迫影響的農(nóng)藝性狀和受影響程度不同。

（2）兩個(gè)不同鎘耐受性香菇菌株不同生長(zhǎng)發(fā)育階段單位干質(zhì)量子實(shí)體中鎘含量均有隨生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)顯著降低的趨勢(shì)。

（3）受到鎘脅迫后菌株4606 生長(zhǎng)期丙二醛含量顯著升高，成熟期顯著下降，開傘期極顯著降低；菌株4625 受到鎘脅迫后開傘期丙二醛含量顯著降低，其余階段未受到顯著影響。

（4）菌株4606 不同處理的可溶性蛋白含量均隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低，菌株4625 不同處理的可溶性蛋白含量均隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)先顯著升高后顯著降低。