豬糞、雞糞經黑水虻轉化后碳、氮及微生物變化

馬葉，吳楠，王小波，梁嘉琪，徐曉燕*

（1.天津農學院農學與資源環境學院，天津 300384；2.天津農墾渤海農業集團有限公司，天津 301800）

隨著我國集約化養殖業的發展，隨之產生了大量的養殖廢棄物[1]，據統計我國每年產生約38 億t 畜禽糞污，但其綜合利用率不足60%[2]。未經處理的畜禽糞便不僅含有對人體和環境有害的重金屬、抗生素和病原菌等物質，還會排放大量惡臭氣體，嚴重威脅周圍的空氣、土壤和水體安全[3-4]。因此畜禽糞便的高效資源化利用對我國畜禽養殖業的可持續發展具有重要意義。

黑水虻是一種腐生性昆蟲，具有繁殖速度快、轉化效率高、抗逆性強、食性廣等特點，可取食畜禽糞便、餐廚垃圾等有機廢棄物[5-6]，并將其轉化為蟲體和蟲糞。黑水虻蟲體含有蛋白質、脂肪和多種微量元素，是一種良好的動物蛋白飼料[7]，蟲糞施用后能提高土壤養分含量，促進作物生長[8]。此外黑水虻轉化后還能降低畜禽糞便中重金屬活性、潛在病原菌豐度和抗生素數量，并有效減少糞便臭味[9-10]。因此利用黑水虻轉化畜禽糞便具有較高的經濟和環境價值。

微生物在黑水虻轉化有機廢棄物中起著至關重要的作用，研究表明黑水虻腸道中的多功能核心菌群有助于其對廢棄物的消化吸收[11]。Ao 等[12]利用黑水虻轉化豬糞和雞糞，在水虻腸道中發現的Rhizobiales、Bacteroidales等菌群，可能與氮的固定、循環等相關，而Providencia則可能與蛋白質、脂類的分解代謝緊密相關。Wu等[10]在轉化豬糞的水虻腸道中發現一些核心 菌 群，如Dysgonomonas、Enterococcus、Morganella等，在有機物降解和腸道健康維護等方面起著重要作用。此外，腸道和基質菌群之間的相互作用也使得黑水虻腸道微生物群落結構向著更利于基質降解的新生態位演化[13]。碳、氮是畜禽糞便中重要的營養元素，也是黑水虻生長代謝所必需的物質。前人的研究已經證實相較于傳統堆肥，黑水虻在實現碳、氮回收利用，減少溫室氣體排放方面具有較大的潛力[14-15]，但對于黑水虻轉化畜禽糞便后碳氮及微生物群落變化還鮮有報道。因此，本文研究了黑水虻轉化豬糞和雞糞前后碳、氮變化規律、菌群結構及相關代謝功能基因變化特征，以期為畜禽糞便的黑水虻高效轉化提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗使用的黑水虻來自天津農學院有機廢棄物資源化研究中心；豬糞取自天津市靜海區某生豬養殖場，雞糞取自天津市寶坻區某蛋雞養殖場。清糞工藝均為干清糞，試驗前將豬糞和雞糞用小塑料袋分裝并放入-20 ℃冰箱冷凍，使用前解凍并將豬糞和雞糞的含水率調至70%。

1.2 試驗設計

本試驗共設計黑水虻轉化豬糞（PBV）和黑水虻轉化雞糞（CBV）兩個處理組，以轉化前的豬糞（PM）和雞糞（CM）作為對照。分別將800 g 豬糞和800 g 雞糞平鋪在塑料盒（長×寬×高：70 cm×45 cm×15 cm）中，再分別接種200 g 黑水虻，每組3 個重復，每日喂食一次（第2 天：1.2 kg；第3 天：1.6 kg；第4 天：2.0 kg；第5天：3.0 kg；第6 天：3.6 kg；第7 天：3.6 kg；第8 天：2.0 kg），喂養8 d后，停止喂食，放置24 h，待蟲體腸道內的糞便完全排出體外后再分離蟲體和蟲糞。分別采集黑水虻轉化前的豬糞、雞糞樣品和轉化后的蟲糞樣品。一部分鮮樣放入-80 ℃冰箱保存，用作細菌群落檢測，一部分鮮樣自然風干，蟲體微波烘干，用作理化性質測定。

1.3 理化指標測定

蟲體和蟲糞的全氮、蟲體粗蛋白采用凱氏定氮法測定[16]；有機質采用重鉻酸鉀容量法測定，總有機碳含量根據公式TOC=有機質/1.724 計算，根據TOC/TN計算C/N[17]；用1 mol·L-1KCl 提取，采用連續流動分析儀測定和含量[18]；樣品與去離子水按照1∶10 混勻，提取可溶性有機質（DOM）[19]，之后采用重鉻酸鉀氧化-比色法測定提取液中可溶性有機質含量，按照可溶性有機質/1.724 計算溶解性有機碳含量[20]；糞便轉化率=增加的蟲體干質量/轉化的糞便干質量×100%，糞便減量率=（糞便干質量-蟲糞干質量）/糞便干質量×100%[21]。

1.4 DNA的提取和16S rRNA基因測序分析

蟲糞的DNA 提取和測序：將樣品CM、CBV、PM和PBV 送至北京百邁克云科技有限公司。采用基因組DNA 提取試劑盒（天根）完成總核酸的提取，再使用酶標儀對提取的核酸進行濃度檢測，合格后對其進行擴增，擴增后的PCR 產物使用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。對質檢合格的樣本構建目標區域PCR 體系并進行純化，再采用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和 引 物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細菌16S rRNA基因的V3 和V4 區進行PCR 擴增，PCR 產物用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后再進行混樣，將混好的樣品進行切膠前純化，之后用Monarch DNA 膠回收試劑盒回收PCR 產物并建立文庫，文庫通過Qsep-400 方法進行質檢，質檢合格后使用Illumina novaseq6000進行上機測序。

1.5 數據分析

統計分析采用SPSS 20.0。在分析之前，使用單樣本Kolmogorov-Smirnov 檢驗檢查數據的正態分布，并使用Levene 檢驗檢查方差的同質性。單因素方差分析（ANOVA）和t檢驗用于確定樣本之間的差異，顯著性水平為P<0.05。使用Usearch 軟件對序列在97.0%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU。利用QIIME2 軟件對樣品α 多樣性和β 多樣性進行分析，再使用Origin 2019 繪制箱型圖，根據bray curtis 算法計算樣品間的距離從而繪制PCoA 圖，使用PICRUSt2軟件進行菌群代謝功能的分析與預測，使用IMG微生物基因組數據進行功能信息的輸出進而推測樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或組分之間在功能上的差異。

2 結果與分析

2.1 黑水虻轉化處理豬糞和雞糞的生產性能

由表1 可知，黑水虻轉化豬糞和雞糞后分別產生了421.18 g和522.13 g干蟲，豬糞和雞糞的轉化率分別為8.36%和10.42%，減量率分別為29.31%和34.98%，蟲體粗蛋白含量分別為42.73%和47.10%，上述結果表明黑水虻對雞糞的轉化效率高于豬糞。

表1 黑水虻處理豬糞和雞糞的生產性能（干質量）Table 1 Production performance of black soldier fly in the treatment of pig manure and chicken manure（dry weight）

2.2 豬糞和雞糞轉化前后碳氮變化

豬糞和雞糞經黑水虻轉化后的理化性質變化如表2 所示。與新鮮豬糞（PM）相比，黑水虻轉化后蟲糞中溶解性有機碳、全氮、硝態氮和銨態氮含量均顯著下降，其降幅分別為17.75%、28.22%、86.73%和93.94%，而總有機碳含量和C/N較PM均顯著增加，增幅分別為5.86%和47.64%；黑水虻轉化雞糞后，蟲糞中總有機碳、可溶性碳、全氮、硝態氮、銨態氮含量和C/N 均顯著下降，相較于新鮮雞糞（CM）其降幅分別為11.67%、42.64%、7.31%、51.54%、51.77%和4.68%。

表2 豬糞和雞糞轉化前后（干質量）碳氮變化Table 2 Changes of carbon and nitrogen in pig manure and chicken manure（dry weight）before and after transformation

2.3 碳、氮在蟲體和蟲糞中的分布

豬糞和雞糞經黑水虻轉化后，其中的碳和氮流動方向可分為三部分：一部分被蟲體轉化吸收，用于自身的生長，一部分保留在蟲糞中，剩余部分則以氣體等形式損失。如圖1 所示，經黑水虻轉化后，豬糞中18.93%的碳和31.42%的氮轉入蟲體，74.83%的碳和43.71%的氮保留在蟲糞中，而6.24%的碳和24.87%的氮則以氣體等形式損失。黑水虻吸收了雞糞中10.49%的碳和32.58%的氮用于自身生長，57.43%和60.25%的碳和氮保留在蟲糞中，最終損耗了32.08%的碳和7.17%的氮。

圖1 轉化豬糞和雞糞后碳、氮分布比例Figure 1 Distribution ratio of carbon and nitrogen after transformation of pig manure and chicken manure

2.4 黑水虻轉化豬糞和雞糞前后細菌群落ɑ和β多樣性分析

黑水虻轉化豬糞和雞糞前后細菌的豐富度和多樣性如圖2a 和圖2b 所示。由Chao1 指數和Shannon指數變化可知，黑水虻轉化后，兩組蟲糞的細菌豐富度和多樣性均高于豬糞和雞糞，其中PM 和PBV 的細菌豐富度和多樣性高于CM 和CBV。由Venn 圖可知（圖2c），PM、CM、PBV 和CBV 處理分別得到了647、535、789個和620個OTU。四組樣品共有的OTU數為327 個，在PM、CM、PBV 和CBV 中 占 比 分 別 為50.54%、61.12%、41.44%和52.74%，這表明經黑水虻轉化后豬糞和雞糞的細菌群落發生了較大改變。PCoA 反映了樣品間物種多樣性差異，樣品間的距離越相近，表明細菌群落結構組成越相似。豬糞和雞糞經黑水虻生物轉化前后的細菌群落相似性如圖2d 所示，其第一主坐標（PC1）和第二主坐標（PC2）的貢獻率分別為48.78%和33.35%，累積貢獻率為82.13%。從圖2d 中可以看出，各處理重復樣本之間聚類較好，4 個處理間的距離相差較遠，細菌群落結構差異較大，這進一步表明黑水虻轉化顯著改變了豬糞和雞糞的細菌群落結構。

圖2 黑水虻轉化豬糞和雞糞前后α和β多樣性變化Figure 2 Changes of alpha-diversity and beta-diversity in chicken manure and pig manure before and after treatment with black soldier fly

2.5 黑水虻轉化豬糞和雞糞前后細菌群落組成變化

細菌群落門水平（前10門）分布如圖3a所示。黑水虻轉化豬糞和雞糞后，糞便中的細菌群落發生了明顯變化，其中厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Pro-teobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是所有樣品的優勢菌門，其平均相對豐度之和占細菌總量的90%以上。黑水虻轉化豬糞后使得糞便中厚壁菌門和擬桿菌門（Bacteroidetes）的平均相對豐度下降，變形菌門、放線菌門和酸桿菌門（Acidobacteria）的平均豐度上升。雞糞經黑水虻轉化后其厚壁菌門平均相對豐度明顯升高，而變形菌門、放線菌門和酸桿菌門的平均豐度均下降。

圖3 黑水虻轉化豬糞和雞糞前后的門（a）和屬（b）水平的細菌群落相對豐度Figure 3 Relative abundance of bacteria community at the phylum level（a）and genus level（b）in chicken manure and pig manure before and after treatment with black soldier fly

細菌群落屬水平（前10 屬）分布如圖3b 所示，豬糞轉化后，糞便中芽孢桿菌綱的細菌如雙芽孢桿菌屬（Amphibacillus）、Atopostipes、大洋芽孢桿菌屬（Oceano-bacillus）和假纖細芽孢桿菌屬（Pseudogracilibacillus）及棒狀桿菌科棒狀桿菌屬（Corynebacterium_1）等的平均相對豐度上升；而厭氧球菌屬（Anaerococcus）、硬毛球菌（Fastidiosipila）、創傷球菌屬（Helcococcus）和梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）等梭菌目細菌平均相對豐度均下降。黑水虻轉化雞糞后，蟲糞中芽孢桿菌綱細菌如雙芽孢桿菌屬、Atopostipes和假纖細芽孢桿菌屬的相對平均豐度均明顯高于雞糞，uncul-tured_bacterium_f_Ruminococcaceae和梭菌屬等梭菌目細菌平均相對豐度分別降低了89.28%和80.58%，但是梭菌目細菌uncultured_bacterium_f_Family_XI的相對豐度升高了10.89 倍。各處理組前20 個屬中芽孢桿菌綱細菌平均相對豐度之和表現為CBV>CM>PBV>PM，梭菌目細菌平均相對豐度之和表現為PM>PBV>CBV>CM。此外，豬糞和雞糞轉化后，PBV 和CBV 中丹毒絲菌屬（Erysipelothrix，丹毒絲菌綱）的平均相對豐度分別上升了6.63 倍和13.47 倍，志賀菌屬（Escherichia-Shigella）的平均相對豐度分別下降了91.67%和97.87%。慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）是CM 和CBV 的優勢菌屬，但黑水虻轉化雞糞后CBV中慢生根瘤菌屬豐度從3.22%下降到了2.71%，而PM和PBV中幾乎沒有檢測到慢生根瘤菌屬。

2.6 微生物代謝功能預測

通過KEGG 代謝途徑的組成及差異分析，可以觀測到不同樣本之間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化。與碳氮代謝相關的前20 種功能基因（KEGG 三級代謝）豐度信息如圖4 所示，黑水虻轉化豬糞和雞糞后，PBV 和CBV 中各種代謝基因的平均豐度均明顯高于PM 和CM，且CBV 的平均基因豐度要高于PBV，可見黑水虻轉化增強了豬糞和雞糞的碳氮代謝，且雞糞轉化組的碳氮代謝比豬糞轉化組更為強烈。20 種功能基因中平均基因豐度最高的前三位分別是ABC 轉運蛋白、氨基酸的生物合成和碳代謝，其中ABC轉運蛋白的平均基因豐度最高。

圖4 與碳氮代謝相關的KEGG三級代謝圖（前20種）Figure 4 Level 3 KEGG metabolism diagram of variation in bacterial function profile related to carbon and nitrogen metabolism（Top20）

3 討論

黑水虻轉化雞糞后蟲體產量、蟲體粗蛋白含量、糞便轉化率和減量率均高于豬糞轉化，這與劉濤[22]的研究結果類似。龐萬程[23]發現使用玉米芯將豬糞C/N調至25 時黑水虻產量最高，本試驗中雞糞和豬糞的C/N 分別為20.02 和13.78，雞糞的C/N 更接近于最優物料組成，這可能是黑水虻對雞糞的轉化率和減量率更高的原因。黑水虻轉化雞糞后蟲體粗蛋白含量顯著高于豬糞轉化，由此推測使用黑水虻轉化雞糞所獲得的經濟效益高于豬糞轉化。

碳、氮是黑水虻生長和發育過程中必需的營養元素，黑水虻可以將豬糞和雞糞中的碳、氮一部分轉化為生物質體，一部分轉入蟲糞中，而轉化后蟲糞中的溶解性有機碳、全氮、硝態氮和銨態氮含量均顯著低于豬糞和雞糞，這與Pang等[15]的研究結果類似。溶解性有機碳是基質中最容易利用的碳源[15]，兩組蟲糞中的溶解性有機碳含量顯著低于豬糞和雞糞，這可能是由于黑水虻吸收利用了糞便中的碳所致[24]。此外，黑水虻腸道中含有能夠合成氨基酸的細菌類群，高水平的氨基酸代謝有利于黑水虻體內的蛋白質迅速積累[12]，從而使得銨態氮和硝態氮可能在這一過程中被大量消耗。黑水虻轉化豬糞后，蟲糞中有機碳含量升高，而轉化雞糞后，蟲糞中有機碳含量降低，這可能是因為豬糞和雞糞的特性不同。

黑水虻轉化豬糞和雞糞后，顯著改變了其微生物群落結構，提高了蟲糞的細菌多樣性和豐富度，這可能是由于黑水虻腸道中的微生物進入蟲糞中所致。厚壁菌門、變形菌門和放線菌門是豬糞、雞糞和兩組蟲糞的優勢菌門，這與前人的研究結果類似[19，25]。隨著黑水虻的轉化，CBV中厚壁菌門豐度明顯高于CM，而豬糞轉化過程則與之相反，且對屬水平分析發現，厚壁菌門中基因豐度較高的屬分別屬于芽孢桿菌綱、丹毒絲菌綱和梭菌綱。有研究表明芽孢桿菌綱中的某些細菌具有分泌蛋白酶，降解蛋白質的能力[17，26]，丹毒絲菌綱細菌具有分解脂肪的能力[27]，兩組蟲糞中的芽孢桿菌綱和丹毒絲菌綱豐度要明顯高于豬糞和雞糞，這表明黑水虻轉化過程中可以通過增加蛋白質降解菌和脂肪降解菌的豐度加速豬糞和雞糞的降解。據報道梭菌目具有分解纖維素、半纖維素和產酸的能力[28]，棒狀桿菌科細菌可以降解木質素、單寧和激素等有機物[29]，本研究中黑水虻轉化后明顯提高了CBV的梭菌目豐度，但降低了PBV 的梭菌目豐度，提高了兩組蟲糞的棒狀桿菌科豐度，這表明黑水虻能夠通過調節不同基質中的細菌群落結構來增加降解纖維素和木質素的細菌豐度，從而達到快速降解豬糞和雞糞的目的。此外，CBV中的慢生根瘤菌屬是一種能與大豆共生固氮的細菌[30]，PBV 中的棒狀桿菌屬能促進亞硝酸鹽的產生[31]，它們在CBV 和PBV 中的分布可能使得黑水虻在轉化豬糞過程中比在轉化雞糞過程中損失更多的氮。

志賀菌屬（Escherichia-Shigella）可能會引發腹瀉、潰瘍性結腸炎等多種腸道疾病，是一種典型的腸道致病菌[32]。本研究結果表明黑水虻轉化豬糞和雞糞后該菌豐度下降了90%以上，這表明黑水虻對糞便中的潛在病原菌具有一定的削減作用。其他研究也證實黑水虻轉化能降低糞便中的病原菌，如Aw-asthi等[33]研究發現黑水虻幼蟲能顯著降低雞糞、豬糞和牛糞中的病原菌豐度，Elhag 等[34]報道稱黑水虻能通過調節腸道相關微生物和抗菌肽的表達等多種機制抑制豬糞中潛在的人畜共患病原體。

黑水虻轉化雞糞和豬糞后，蟲糞中ABC 轉運蛋白的基因豐度最高，研究表明ABC 轉運蛋白具有促進糖類和氨基酸等物質運輸的作用[35]，其在PBV 和CBV 中大幅增加表明黑水虻加快了豬糞和雞糞轉化體系中微生物的物質代謝。CBV 中氨基酸合成基因豐度和碳代謝基因豐度均顯著高于PBV，這也進一步證明了為什么黑水虻轉化雞糞過程中的氮損失要明顯低于豬糞轉化，而黑水虻轉化豬糞過程中則保留了更多的碳。黑水虻轉化豬糞和雞糞過程中分別損失了6.24%和32.08%的碳及24.87%和7.17%的氮，袁京等[36]研究指出，傳統堆肥過程可能會造成48.7%的碳和27.7%的氮損失，這一數據明顯要高于黑水虻轉化過程中的碳氮損失，這說明相較于傳統堆肥，黑水虻轉化對減少豬糞和雞糞的碳、氮損失具有更大的潛力。

黑水虻轉化處理豬糞和雞糞后增加了糞便中有機物降解菌豐度，加快了碳、氮代謝，實現了糞便中碳、氮物質的高效利用，但關于畜禽糞便轉化過程中碳、氮損失的調控還需進一步的研究，以減少其碳、氮損失，提高轉化效率。

4 結論

（1）黑水虻可生物轉化畜禽糞便，提高其資源化利用率。黑水虻對雞糞的轉化率高于豬糞，豬糞轉化后有機碳含量和C/N 提高，雞糞轉化后有機碳含量和C/N 降低，而兩者的溶解性有機碳、全氮、硝態氮和銨態氮含量都降低。豬糞、雞糞經黑水虻轉化后碳、氮大部分轉入蟲糞，雞糞中的碳損失高于豬糞，而豬糞氮損失高于雞糞。

（2）黑水虻轉化豬糞和雞糞后顯著改變了其微生物群落結構，提高了細菌群落豐富度和多樣性，增加了蟲糞中蛋白質和脂肪降解菌豐度，增強了糞便中微生物的碳、氮代謝，其中ABC 轉運蛋白、氨基酸的生物合成和碳代謝基因在蟲糞中更加豐富，且雞糞源蟲糞的碳氮代謝基因豐度要高于豬糞源蟲糞。