psm-mec 與硝酸鎵在生物被膜人葡萄球菌快速診斷與治療中的臨床應用意義研究*

陳亮 陳詩言 唐靈 呂云霞 王曉燕

（四川省什邡市人民醫院檢驗科 什邡 618400）

人葡萄球菌是臨床血培養分離中最常見的致病菌之一，可導致多種急性皮膚和軟組織感染甚至更嚴重的疾病，如導管相關性菌血癥、心內膜炎、壞死性肺炎和骨髓炎等[1]。由于其常呈多重耐藥且易產生生物被膜，造成感染反復、遷徙，治療難度大，臨床預后差[2]。自20 世紀60 年代初人葡萄球菌被發現以來，其導致的各種疾病發病率和病死率較高，并給公共衛生系統造成了相當大的負擔[3]。臨床上對多重耐藥（Multi-drug Resistance,MDR）與生物被膜（BF）陽性人葡萄球菌診療的難點在于缺乏早期預測多重耐藥與生物被膜的標志物，同時在治療上對MDR 和（或）BF 菌株缺乏有效的抑菌與抑BF 藥物。研究表明，在表皮葡萄球菌中攜帶psm-mec 基因菌株耐甲氧西林，易呈MDR 與BF 陽性[4]。基因突變和獲得含有耐藥基因的可移動遺傳元件（MGEs）是導致微生物耐藥的兩種常見機制，最重要的葡萄球菌MGEs 是葡萄球菌盒式染色體mec（SCCmec）。近年的研究發現，在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的特定類型SSCmec 元件中發現了一個獨特的位點，它包括一個小的調節核糖核酸[(sr)RNA]和一個編碼細胞溶解肽psm-mec 的嵌入基因。psm-mec 屬于葡萄球菌產生的兩類α-螺旋多肽毒素的酚溶性調素（PSM）家族，它們共同在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌發病的許多方面作為毒力決定因素發揮重要作用[5]。越來越多的文獻報告顯示，硝酸鎵（Gallium Nitrate,GaN）是一種有效的抑菌與抑BF物質[6]。鎵化合物對幾種重要的細菌病原體，如結核分枝桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌均有體外和體內抗菌活性[7]。本研究擬通過對psm-mec 基因與生物被膜相關性的研究，尋找一種快速診斷生物被膜陽性人葡萄球菌的標志物，同時就硝酸鎵對人葡萄球菌的抑菌與抑制生物被膜能力進行研究，為臨床血液來源人葡萄球菌的診斷與治療提供新的思路。現報道如下：

1 材料與儀器

1.1 菌株來源 收集臨床受試對象的血液，參照細菌培養方法對陽性樣本進行培養，將培養完成的菌株進行分離、純化，最后使用全自動微生物鑒定儀（VITEK2 COMPACT）進行鑒定，總計得到85 株人葡萄球菌且無重復菌株。

1.2 試劑與材料 聚合酶鏈式反應（PCR）試劑（北京全式金生物技術股份有限公司），引物（上海Sangon Biotech 公司），核酸提取試劑（重慶中元匯吉生物技術股份有限公司），硝酸鎵（美國sigma 公司），結晶紫（珠海BASO 生物技術有限公司），ABI7500 型實時熒光定量PCR 擴增儀（美國ABI 公司），VITEK2 COMPACT 型全自動藥敏鑒定系統（法國梅里埃公司），96 孔無菌培養板（美國Costar公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌收集與DNA 的提取 將培養、分離、純化、鑒定得到的人葡萄球菌接種到含有細菌保存液的離心管內，并在液氮中進行低溫保存。復蘇時在水浴箱內進行解凍復蘇，隨后將復蘇成功的人葡萄球菌接種至平板培養皿內，并在37℃、5%CO2培養箱內進行培養。培養24 h 后對人葡萄球菌進行收集，低溫離心機1 200 r/min 離心5～10 min，棄去上清，向離心管底部的細菌沉淀加入100 μl 前處理液，振蕩離心管使之混勻，最后將細菌懸液在90℃金屬浴中放置5～6 min。使用磁珠法對人葡萄球菌脫氧核糖核酸（DNA）進行提取。

1.3.2 PCR 擴增人葡萄球菌psm-mec 基因 引物序列為psm-mec F5-CGAAAGCCTGAATGCAAGTCT-3'psm-mec R5GGATTTCACTGGTGTTATTACAAGC-3'。反應體系：2×perfectStart Green qPCR SuperMix 10 μl，上下游引物各0.4 μl，50×0.4 μl，水7 μl，DNA 模板2 μl。PCR 擴增反應條件：95℃3 min，95℃5 s，42℃15 s，72℃34 s，40 個循環。

1.3.3 生物被膜形成能力分析 首先將新鮮的單克隆人葡萄球菌接種于培養皿內，并向培養皿內加入適量的溶菌肉湯，將培養皿移至培養箱內增菌過夜。培養完畢后使用移液槍將菌液移至EP 管內，按照1:200 的比例加入胰蛋白胨大豆肉湯（含0.25%葡萄糖）對菌液進行稀釋。吹打均勻后，將重新混勻的菌液加入到96 孔細胞板內，每孔200 μl 且每個樣本設置8 個復孔，在37℃、5%CO2培養箱內培養3 d，培養結束后使用磷酸鹽緩沖液（PBS）進行洗板，將未黏附于細胞板底的細菌洗去，最后烘箱內進行干燥。使用結晶紫染液對板底細菌進行染色，染色時間為5～10 min，染色結束后使用PBS 洗滌3 次，自然晾干。最后每孔加入5%的乙酸，并使用多功能酶標儀于570 nm 波長處讀取吸光光度值。

1.3.4 硝酸鎵抑菌能力檢測 在測量硝酸鎵對人葡萄球菌的最低抑菌（MIC）濃度時使用常量肉湯稀釋法。首先將人葡萄球菌接種于培養皿內，并在37℃、5%CO2培養箱內培養1 d，待細菌生長狀態良好且處于對數生長期時，取菌落接種于新的培養皿內，并將細菌懸液調整為0.5 麥氏單位。取無菌96 孔細菌培養板，在A1 孔中加入300 μl 的人型支原體（MH）做陰性對照孔，而A2～A10 孔首先加入150 μl MH，然后在A2 孔中加入配置好的1 000 mmol/L 的抗菌藥物母液150 μl，倍比稀釋直至到A10 孔，棄去150 μl，得到濃度梯度為5 000 μmol/L、2 500 μmol/L 至19.53 μmol/L 共計9 個等比梯度。然后每孔加入150 μl 配置好的0.5 麥氏單位菌懸液，B～H 行以同樣的方式完成剩余7 株菌株的加樣，然后整板混勻，37℃，5%CO2培養20～24 h 后讀取結果。當沒有細菌生長的孔且使用的硝酸鎵濃度為最低時，即得到了人葡萄球菌的最低抑菌濃度，該實驗需重復3 次。

1.3.5 硝酸鎵抑菌生物被膜能力分析 根據GaN的MIC 結果，選用312.5 μmol/L（MIC50）和625.0 μmo1/L（MIC90）2 個濃度的硝酸鎵溶液對47 株BF陽性的菌株進行抑BF 研究。取兩塊96 孔無菌板，同時鋪板培養人葡萄球菌，實驗組培養板鋪板后待細菌貼壁即棄去培養液，并在每孔中加入312.5 μmol/L 的硝酸鎵培養液，用于檢測BF 初期（黏附期）硝酸鎵對其的抑制作用，而對照組不做棄菌處理。同理完成625.0 μmo1/L 的硝酸鎵對生物被膜形成成熟期（14 h）的抑制作用實驗。所有96 孔培養板，靜置培養24 h，棄去菌液，用超純水洗3 次，60℃干燥，每孔加入200 μl 0.1%的結晶紫染色10 min，用去離子水洗3 次。在烘箱內將細胞板進行干燥，干燥完成后加入乙酸溶液并使用多功能酶標儀于550 nm 波長處讀取吸光光度值。生物被膜的抑制率計算公式為：抑制率=（1－實驗組A550/對照組A550）×100%。

1.4 統計學分析 采用SPSS21.0 統計學軟件，計數資料以%表示，采用χ2檢驗，計量資料以（）表示，采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 psm-mec 基因的檢測與BF 的篩查 共收集85 株臨床人葡萄球菌，排除重復株，32.94%（28/85）的菌株檢出psm-mec 基因，55.29%（47/85）的菌株BF 陽性。見圖1。

圖1 psm-mec 基因的檢測與BF 的篩查結果

2.2 psm-mec 與生物被膜的相關性 攜帶與未攜帶psm-mec 基因的菌株形成BF 比率分別為82.14%（23/28）和42.10%（24/57），兩者差異顯著（P＜0.05）。見表1。

表1 psm-mec 與生物被膜的相關性[例（%）]

2.3 硝酸鎵抑菌能力分析 肉湯稀釋法對85 株人葡萄球菌進行GaN 的MIC 檢測，MIC 的濃度跨度范圍為312.5～625.0 μmol/L，其中MIC50為312.5 μmol/L，而MIC90為625.0 μmol/L。見圖2。

圖2 硝酸鎵抑菌能力分析圖

2.4 硝酸鎵對人葡萄球菌生物被膜抑制率與濃度和時間的關聯性 根據MIC 結果，研究中選用312.5 μmol/L 和625.0 μmol/L 的硝酸鎵溶液進行抗生物被膜的研究。312.5 μmol/L 的硝酸鎵對初期（4 h）BF 的抑制率為（55.33±6.25）%，對成熟期（14 h）BF 的抑制率僅為（32.11±5.24）%，對生物被膜的抑制作用較弱。625.0 μmol/L 的硝酸鎵對初期（4 h）BF的抑制率為（88.21±2.55）%，對成熟期（14 h）BF 的抑制率僅為（51.32±5.69）%。硝酸鎵對人葡萄球菌BF 抑制率存在濃度與時間關聯性，濃度越高抑制率越高，差異有統計學意義（P＜0.05）；同時，不同濃度的GaN 干預時間越早抑制率越高，初期的抑制率明顯高于成熟期的抑制率，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 硝酸鎵對人葡萄球菌生物被膜抑制率與濃度和時間的關聯性

3 討論

人葡萄球菌是凝固酶陰性葡萄球菌（CoNS）的一種。在CoNS 中，人源性鏈球菌是最常見的從住院患者血液中提取的3 種分離株之一。這些細菌被認為是潛在的機會性病原體，可能導致血流感染、心內膜炎、腹膜炎、骨髓炎、骨骼和關節感染等疾病[8]。葡萄球菌引起的大多數感染與使用留置醫療器械有關，然而其致病的確切機制尚未確定[9]。相關實驗發現人葡萄球菌易產生多重的耐藥性，同時還易產生生物被膜[10]。耐藥與生物被膜兩者相互交織，給臨床的診療造成了極大的難度，如何快速有效地評估診斷人葡萄球菌以及研發更加有效的治療藥物是臨床研究熱點難點所在。

抗菌素的耐藥性特別是耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）成為臨床面臨的一個主要難題[11]。在SCCmec 元件上獲得mec 基因可產生甲氧西林耐藥，這與多種抗菌藥物耐藥事件有關[12]。SCCmec 元件是獨特的可移動遺傳元件，編碼對甲氧西林和幾乎所有β-內酰胺類抗生素的耐藥；它們可整合到orfX 基因內的葡萄球菌染色體附著位點（attB）。mec基因復合體、盒狀染色體重組酶（ccr）基因復合體和毗鄰區域是SCCmec 元件共有的核心結構和關鍵遺傳成分[13]。SCCmec 結構高度復雜，在不同的葡萄球菌種中發現的大小范圍很寬[14]。本研究表明psm-mec 也存在于人葡萄球菌中，且本研究中32.94%（28/85）的菌株檢出psm-mec 基因，所有psm-mec 陽性菌株耐甲氧西林。同時96 孔板結晶紫生物被膜形成實驗顯示，共計47 株菌株BF 陽性，檢出率為55.29%，表示耐藥與生物被膜是人葡萄球菌致病力最為主要的2 個因素[15]。攜帶與未攜帶psm-mec 基因的菌株形成BF 的比率分別為82.14%（23/28）和42.10%（24/57），二者差異顯著（P＜0.05），提示psm-mec 基因與生物被膜形成密切相關，這與文獻報道相符。這充分表明psm-mec 基因是一個理想的標志物，可用于早期快速預測判斷臨床分離人葡萄球菌致病力（耐藥與產生物被膜能力）。鎵的許多活性源于它與鐵離子（Fe3+）的化學相似性。有相關研究表明，在生物膜的形成早期必須依賴高濃度的鐵。因此采用鐵螯合劑降低體內Fe 離子濃度的方法來抑制細菌，然而在實驗中研究人員發現抑菌效果并不理想，因為螯合劑中的鐵仍然可以被細菌利用，而且細菌有很強的富集Fe 離子的能力。臨床上，GaN 在多發性骨髓瘤、膀胱癌、淋巴瘤、卵巢癌和肝細胞癌的治療中都扮演著重要角色。同時國外有研究證實GaN 可以顯著增強其他抗生素的抑菌能力。最近的研究表明，鎵可以作為一種“特洛伊木馬”，有幾乎相同的離子半徑。鎵隨后可能會破壞鐵依賴的過程，因為與鐵不同，它不能在生理條件下被還原。該策略成功地抑制了耐藥銅綠假單胞菌的生長和生物被膜形成。根據MIC 結果，研究選用312.5 μmol/L 和625.0 μmol/L 的GaN 溶液進行抗生物被膜的研究。為了觀察一定濃度對人葡萄球菌不同時期生物被膜的抑制作用，選擇了生物被膜形成初期和成熟期進行研究，結果顯示，312.5 μmol/L 的硝酸鎵對初期生物被膜的抑制率為（55.33±6.25）%，具有較強的生物被膜抑制作用；對成熟期生物被膜的抑制率僅為（32.11±5.24）%，抑制作用較弱。625.0 μmol/L 的硝酸鎵對初期生物被膜的抑制率為（88.21±2.55）%，具有很強的生物被膜抑制作用；對成熟期生物被膜的抑制率僅為（51.32±5.69）%，抑制作用有所降低。通過統計學分析發現，GaN 對人葡萄球菌生物被膜形成早期的抑制率高于成熟期的抑制率。

綜上所述，在人葡萄球菌中psm-mec 與生物被膜能力密切相關，GaN 是一種有效的抑菌與抑生物被膜物質。