1株木質素降解菌的篩選、鑒定及固態發酵產酶優化

寇 慧 黃長浩 嚴 騁 鄒 偉

（四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644005）

油菜是我國的主要油料作物之一，種植面積居世界前列[1]。目前，油菜秸稈的處置方式多為露天焚燒和自然降解，會造成資源浪費和環境污染，因此探究優質高效的秸稈資源綜合利用方法成為熱點話題[2]。但油菜秸稈木質化程度高、生物質結構復雜，造成其利用難、利用率低。高效且低成本的降解技術是實現資源化利用油菜秸稈的亟須解決的難題。目前，油菜秸稈的降解方法主要有物理處理法、化學處理法、生物處理法，其中生物降解技術操作簡單、生產費用較低且效用高，不會污染環境，在降解纖維素類物質方面具有巨大的潛力[3]。

秸稈的主要成分包括木質素、纖維素和半纖維素，木質素和半纖維素以共價鍵的形式形成一種天然的屏障包裹纖維素，防止纖維素被酶解[4]。木質素結構復雜，對纖維素和半纖維素的酶解產生可發酵糖及高附加值產品的開發形成了一定阻礙，因此能否有效去除木質素也會影響纖維素和半纖維素的有效利用[5]。生物降解木質素主要借助于自然界中真菌、放線菌、細菌等，與細菌相比，真菌降解木質素的能力較強，且具有產生多種氧化還原酶的能力[6-7]，在木質素解聚方面起重要作用，其中關于白腐真菌的研究最多。但白腐真菌存在效率低、碳水化合物損失大、覆蓋面積大、發酵周期長等缺點，因此有需要篩選新菌株、探索新方法降解木質素[8]。本研究從腐爛木頭及土壤中篩選、分離、鑒定具有木質素降解能力的真菌，進一步探究了該菌株以油菜秸稈為底物的固態發酵產酶優化以及降解效果，為后續油菜秸稈生物降解提供高效微生物資源，為秸稈的資源化利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

土壤和腐爛木頭采自四川輕化工大學匯南校區樹林里含腐爛木頭的土壤地表下2～5 cm 處，使用無菌袋包裝，冰袋保存帶回實驗室，4 °C冰箱保存。

1.1.2 培養基

富集培養基：葡萄糖5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 mL，pH 值自然，121 ℃高壓滅菌20 min。

初篩培養基：木質素2 g、硫酸銨2 g、磷酸二氫鉀1 g、磷酸氫二鈉0.2 g、瓊脂20 g，pH 值7.0，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min，倒平板備用[9]。

復篩培養基：

愈創木酚-PDA：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水定容至1 000 mL，pH 值6.0～6.5，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至不燙手，使用0.22 μm 濾膜過濾，除菌，加入0.1%愈創木酚[9]。

苯胺藍-PDA：馬鈴薯200 g、酵母膏20 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、NaCl 5 g、蒸餾水定容至1 000 mL，pH 值5.5 左右，瓊脂20 g；滅菌，冷卻至不燙手，用0.22 μm濾膜過濾除菌加入0.1 g苯胺藍，倒平板備用[10]。

木質素降解培養基[10]：堿性木質素2 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 1 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

初始固態發酵產酶培養基[10]：預處理過的油菜秸稈3.0 g、麩皮2 g 裝入150 mL 錐形瓶中，以料液比1∶2 加入營養液搖勻。

營養液為KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、(NH4)2SO410 g/L、蛋白胨1.0 g/L。

所有培養基均需1×105Pa滅菌30 min后冷卻。

1.1.3 試劑與儀器

1.1.3.1 試驗試劑

木質素、堿性木質素、鐵氰化鉀、乳酸鈉購自上海麥克林生化科技有限公司；葡萄糖、氯化鐵購自成都市科隆化學品有限公司；2,2-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）購自合肥巴斯夫生物科技有限公司；苯胺藍、愈創木酚購自上海泰坦科技股份有限公司；藜蘆醇購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3.2 試驗儀器

HH-4恒溫水浴鍋購自上海力辰邦西儀器科技有限公司，LRH-300 生化培養箱購自常州諾基儀器有限公司，UV-1800紫外/可見分光光度計購自上海美譜達儀器有限公司，SW-CJ-2D 型超凈工作臺購自上海蘇凈實業有限公司，PHS-3C 酸度計購自成都世紀方舟科技有限公司，LS-50HJ 立式壓力蒸汽滅菌器購自江陰濱江醫療設備有限公司，F2000全自動纖維分析儀購自濟南海能儀器股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 油菜秸稈的預處理

參考王輝等[11]預處理秸稈方法，稱取20.00 g 粉碎至過20 目篩的油菜秸稈粉，置于250 mL 錐形瓶中，加入200 mL 1.1% NaOH（液料比為10 mL/g），密封，置于45 ℃環境中浸泡36 h，置于濾袋中洗至中性，烘干至恒重，稱量。

1.2.2 木質素降解菌株的分離篩選

取10 g土壤樣品于已滅菌的50 mL富集培養基中，放入搖床28 ℃、180 r/min富集7 d。取出在超凈工作臺內取上清液1 mL梯度稀釋至10-1～10-8，吸取10-5、10-6、10-7、10-8各200 μL涂布于初篩培養基上，每個梯度設置3個重復。28 ℃恒溫培養箱中培養3 d，選擇生長旺盛的菌株轉接至初篩分離培養基上進行劃線分離純化，直至得到純菌，并對篩選得到菌株進行編號。

挑取初篩培養基上的單菌落，使用牙簽點種至愈創木酚-PDA、苯胺藍-PDA 培養基上的中心，28～30 ℃恒溫培養5 d，分別挑取周邊有紅色顯色圈、脫色圈明顯的菌株，反復劃線純化，保藏。

1.2.3 木質素降解菌的鑒定

將篩選出的菌株M20 根據菌落培養特征和菌體結構特征，參考《真菌鑒定手冊》[12]進行初步鑒定，將菌種送至上海生工進行內轉錄間隔區（ITS）測序，測序結果使用BLAST 程序在NCBI GenBank 數據庫進行同源性分析，利用MEGA 5.0 軟件計算序列的相似度，使用Neighbor-joining 法構建菌株系統發育樹，確定物種的系統發育地位[13]。

1.2.4 木質素降解菌株降解率測定

采用普魯士法[14]測木質素濃度，將菌株涂布于初篩培養基平板上，均勻鋪滿平板后，使用打孔器做成直徑8 mm 菌塞，每個木質素降解培養基中無菌操作接種5個菌塞，28 ℃、150 r/min降解5 d，取出，搖勻，過濾掉菌的孢子，濾液使用0.22 μm濾膜抽濾，所得濾液測木質素含量。木質素含量標準曲線操作步驟參考文獻[13]，得到回歸方程y=0.028 2x+0.030 1（R2=0.992 2）。

1.2.5 木質素降解菌株酶活測定

木質素胞外漆酶（Lac）、木質素過氧化物酶（Lip）和錳過氧化物酶（MnP）活性的測定具體操作步驟參考文獻[15-17]。

1.2.6 固態發酵產酶單因素優化

碳、氮源優化：在初始固態發酵產酶培養基的基礎上，分別選取秸稈與麩皮比為4∶1、3∶1、2∶1、3∶2、1∶1，選取蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨作為氮源，初始添加量為3%。選出最優氮源后，分別選取1%、2%、3%、4%添加量，在發酵條件為接種量10%、28 ℃、5 d進行試驗。

采用最優碳氮源，即秸稈、麩皮比3∶1，硫酸銨2%，分別選取液料比1、2、3、4 L/g，發酵溫度24、28、32、36、40 ℃，發酵時間為2、3、4、5、6、7 d，接種量分別取5%、10%、20%、25%、30%進行單因素優化。

1.2.7 固態發酵產酶優化正交試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇對固態發酵產酶影響較大的因素設計正交試驗，進一步獲得最佳工藝條件，以秸稈與麩皮比（A）、時間（B）和氮源添加量（C）作為3 個因素，選取3 個水平進行試驗。采用L9（34）正交表進行正交試驗設計，確定固態發酵產酶的最佳工藝。正交試驗因素及水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平設計

1.2.8 驗證試驗

以最優發酵工藝檢驗正交法所獲得的結果的可靠性，通過比較初篩發酵條件和優化后的酶活，評價優化前后發酵條件對固態發酵產酶的影響。

1.2.9 油菜秸稈降解率的測定方法

參照GB/T 20805—2006、GB/T 6434—2006，采用濾袋法分別測定飼料中的酸性洗滌木質素含量和粗纖維含量。將發酵油菜秸稈粉碎過40目篩，稱取約0.5 g左右發酵油菜秸稈于濾袋封口，將濾袋放入燒杯中用石油醚浸沒10 min 脫脂，在通風櫥晾干。放入F2000 全自動纖維分析儀中，設置不同程序進行消煮和洗滌，取出濾袋，瀝干水分，放入丙酮中浸沒5 min，通風櫥晾干，放入烘箱（100±2）℃烘干至恒重，馬弗爐灰化至恒重，計算酸性洗滌木質素含量、粗纖維含量。

2 結果與分析

2.1 木質素降解菌的篩選

從初篩培養基上共挑出56株菌，共有20株菌出現褪色圈或/和顯色圈。其中14株菌株同時在愈創木酚-PDA培養基、苯胺藍-PDA 培養基上顯色/褪色圈出現時間較快且直徑圈較大，表明其產漆酶和過氧化物酶能力較強。但僅通過褪色圈/顯色圈只能簡單判斷產酶的特性，無法具體了解酶的活性，因此還需后續試驗加以驗證。將14株菌株分別接入木質素降解培養基中通過發酵后測木質素降解率進行下一步復篩，結果顯示，降解率大于30%的有10株菌，再分別接入以油菜秸稈為唯一碳源的初始固態產酶培養基中，以篩選出高效降解油菜秸稈的菌株。10株木質素降解菌的木質素酶活見表2。

表2 10株木質素降解菌的木質素酶活 單位：U/g

由表2可知，菌株M8的漆酶最高，但其余兩種酶活很低；M20、M4-2 的3 種酶活均較高，M20 的均略高于M4-2，且M20的苯胺藍褪色效果以及木質素降解效果比M4-2好，因此最終確定M20為目的菌株進行后續研究。

2.2 木質素降解菌的鑒定

2.2.1 菌株M20的形態特征及顯微觀察結果（見圖1）

圖1 菌株M20的形態特征及顯微觀察結果

由圖1可知，菌株M20在苯胺藍-PDA、愈創木酚-PDA平板上均呈黃綠色，絲絨質地，菌絲為致密短絨狀，向四周擴展，邊緣不規整，在平板上呈中央凸起生長。顯微鏡觀察菌體形態，菌株具有分生孢子梗，孢梗莖壁薄且長，壁平滑，頂端有球形頂囊，由頂囊的小梗產生孢子，分生孢子頭輻射狀。結合鄧維琴等[18]對米曲霉的鑒定研究結果，初步判斷篩選出的M20菌株為米曲霉。

2.2.2 菌株M20的ITS序列分析及系統發育樹

雙向測序獲得菌株M20 的ITS基因序列，經拼接后在NCBI 數據庫中進行序列同源性比對，選取BLAST 中相似度較高的真菌序列，利用MEGA5.0計算真菌序列相似度，采用其中的Neighbor Joining 法構建系統發育樹，結果見圖2。由圖2 可知，M20 與AspergillusoryzaeBS A2 在同一個分支上，序列相似性為100%。因此，將該菌株初步命名為A.oryzaeM20。

圖2 菌株M20系統發育樹

2.3 固態發酵產酶優化單因素試驗結果（見圖3～圖9）

圖3 秸稈與麩皮比對固態發酵產酶的影響

圖4 不同氮源對固態發酵產酶的影響

圖5 氮源添加量對固態發酵產酶的影響

圖6 接種量對固態發酵產酶的影響

圖7 發酵時間對固態發酵產酶的影響

圖8 溫度對固態發酵產酶的影響

圖9 液料比對固態發酵產酶的影響

由圖3 可知，當秸稈與麩皮比例為3∶1 時，木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶均達到峰值，漆酶的酶活略低于秸稈與麩皮比為2∶1和1∶1；考慮秸稈的利用率最大化，選擇秸稈與麩皮比例4∶1～2∶1進行后續試驗。

由圖4、圖5 可知，以硫酸銨為氮源時，3 種酶活性均最高。隨著硫酸銨含量的增加，3種酶的活性均上升再下降，其中漆酶和木質素過氧化物酶的在硫酸銨含量為2%時達到峰值，錳過氧化物酶在硫酸銨含量為3%時達到峰值；當硫酸銨含量為4%時，3種酶活性均下降。因此，選擇2%～4%硫酸銨含量進行后續試驗。

由圖6 可知，當接種量在5%～20% 范圍內時，3 種酶活波動幅度不大。因此，接種量對產酶結果影響不大，分析原因是接種量過多，微生物生長旺盛，使環境競爭加劇，微生物群提前衰亡期，且在進入主要代謝階段之前底物已經大量被消耗，使最終產物減少。

由圖7可知，隨著發酵時間延長，3種酶活均逐漸升高，到6 d時，3種酶活性均下降。

因此，本試驗選擇發酵時間為3～5 d 進行后續試驗。

由圖8 可知，24～32 ℃范圍內，3 種酶活性隨著溫度的升高而逐漸增大，在米曲霉最適生長溫度32～36 ℃范圍內[19]，3 種酶活性均逐漸下降。因此，選取32 ℃作為后續試驗。

由圖9 可知，液料比為1～2 時，漆酶與木質素過氧化物酶活性均隨著液料比增加而增加，而錳過氧化物酶活性呈下降趨勢；液料比大于2 時，隨時液料比增加，3 種酶活性均下降，可能是固態發酵適宜霉菌生長，水分含量過大會導致培養基透氣性不足，影響菌株生長，產酶降低[20]。

2.4 固態發酵產酶正交試驗優化結果

為考察各因素之間的關系及影響，進一步優化各因素的最佳量，應用SPSS 24軟件，設計秸稈與麩皮比、發酵時間、氮源添加量3因素3水平的正交試驗，正交試驗結果見表3，方差分析見表4～表6。

表3 正交試驗結果及極差分析

表4 錳過氧化物酶方差分析

表5 漆酶方差分析

表6 木質素過氧化物酶方差分析

由表3～表6可知，氮源添加量對3種酶活力影響均顯著（P＜0.05），發酵時間僅對過氧化物酶活力影響顯著（P＜0.05），對其余兩種酶活力影響不顯著（P＞0.05），而秸稈與麩皮比例對錳過氧化物酶和漆酶活力影響顯著（P＜0.05），對木質素過氧化物酶活性影響不顯著（P＞0.05），因此最佳方案為A3B2C2，即產木質素過氧化物酶最佳的發酵條件為秸稈與麩皮比為2∶1、時間4 d、(NH4)2SO4添加量為3%；產錳過氧化物酶最佳的發酵條件為秸稈與麩皮比為2∶1、時間4 d、(NH4)2SO4添加量為3%；產漆酶最佳的發酵條件為秸稈與麩皮比為2∶1、時間5 d、(NH4)2SO4添加量為3%。根據極差分析結果，產漆酶的最佳方案為A3B3C2，即產漆酶的最佳發酵條件中僅發酵時間與另兩種酶發酵時間不同，但發酵時間僅對過氧化物酶活力影響顯著，因此以過氧化物酶的最佳發酵時間為準，最終最佳方案為A3B2C2。

2.5 最優發酵條件的驗證

以正交試驗得到的最優發酵培養條件組合為秸稈與麩皮比為2∶1、(NH4)2SO4添加量為3%、發酵4 d進行試驗驗證。優化后木質素過氧化酶從1 121.03 U/g 上升到1 796.74 U/g，提高了60.28%；錳過氧化酶從101.13 U/g上升至146.78 U/g，提高了45.14%；漆酶從3.135 U/g 上升至3.979 U/g，提高了27.00%。

2.6 油菜秸稈中木質素、纖維素的降解率

在最優發酵培養基條件下，未接菌的秸稈固體培養基粗纖維含量47.76%、木質素含量為13.34%；接入菌株M20 經過發酵后的秸稈固體培養基粗纖維33.09%、木質素含量為6.71%。菌株M20 對油菜秸稈中木質素降解率達49.70%，粗纖維降解率達30.72%，均高于?ilerd?i?等[21]利用Ganodermaapplanatum對秸稈的木質素、纖維素的降解率。

將未發酵的油菜秸稈固體培養基發酵基質與發酵過后的秸稈培養基基質分別烘干、粉碎、過篩，用導電雙面膠帶固定在樣品臺上，在真空環境下進行鍍金處理，物料表面形成一層導電膜后，用掃描電子顯微鏡進行觀察秸稈表面形態變化[22]，結果見圖10。

由圖10可知，未發酵的秸稈表面光滑，結構緊密且完整，試驗組秸稈經菌株發酵處理后可見，菌體孢子覆蓋、夾雜在秸稈細胞中，秸稈致密完整的結構被破壞。

3 討論

李佳少[23]將米曲霉CGMCC5992 進行固態發酵后，發現錳過氧化物酶達到2.08 U/g，木質素過氧化物酶達到1.79 U/g，而通過單因素和響應面試驗優化了米曲霉CGMCC5992固態發酵培養的工藝條件，得到木質素過氧化物酶最大酶活值可達到6.62 U/g，秸稈木質素降解率達40.25%。本研究篩選的米曲霉M20 產的錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶活均遠高于上述研究結果，同時還能夠產漆酶。張芳芳等[4]利用白腐真菌接種到玉米秸稈固體培養基中，發酵過程中漆酶活性最高值為21.36 U/g，錳過氧化物酶活性峰值0.32 U/g，木質素過氧化物酶峰值為15 U/g。與張芳芳等[4]的研究結果相比，本研究中的菌株M20 的漆酶活性較低，但木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶分別是其119倍和456倍。由M20的固態發酵產酶結果發現，米曲霉M20 在油菜秸稈為底物的固態發酵中，木質素過氧化物酶在木質素降解中起主要作用，與Pinto等[24]報道的木質素過氧化物酶在固態發酵占優勢的結果一致，與Fackler 等[25]用白腐菌降解木質素時，錳過氧化物酶起主要作用結果不同，可能是不同菌種代謝差異導致[26]。

此外，與已報道其他種屬的木質素降解菌相比，M20 在短時間、低能耗的發酵條件下對水溶堿性木質素和油菜秸稈（天然木質素）均具有較強的降解能力。李靈靈等[10]以白腐菌BYL-7 發酵5 d 對堿性木質素降解率為36.5%，培養8 d 對秸稈木質素降解率為32.8%，而M20 在液體培養基中發酵5 d 對堿性木質素降解率約為40%，固態發酵5 d后對秸稈木質素降解率達49.70%，分別提高了4.5%和16.9%。Zhu等[27]以變色栓菌為木質素降解試驗菌株，發現秸稈木質素降解率為34.8%，本試驗中M20的木質素降解率提高了14.9%，且明顯縮短了發酵周期。范寰等[28]利用復合木質素菌系發酵30 d 時，秸稈的木質素降解率達到（57.0±0.2）%，雖M20 秸稈木質素降解率比其低（7.3±0.2）%，但發酵周期縮短了7.5倍。

4 結論

本研究分離篩選的菌株米曲霉M20 具有較強的產木質素酶活和木質素降解能力，對其利用油菜秸稈固態發酵培養基進行發酵優化，在初始發酵培養基的基礎上改變秸稈與麩皮比為2∶1、(NH4)2SO4添加量為3%、發酵4 d可明顯提高其產木質素酶活能力，且油菜秸稈中木質素降解率達49.70%，粗纖維降解率達30.72%。該菌株在油菜秸稈生物降解方面具有較大的開發利用前景，一定程度上為秸稈資源化利用提供了新的微生物資源。后續還可利用此菌株與其他菌株結合處理油菜秸稈，多菌協同產酶，使酶系統更加完整，提高油菜秸稈的降解率。