LIPI-4 EII對單核細胞增生性李斯特菌關鍵毒力 因子轉錄調控的影響

史唯地 馬 勛 劉彩霞 寇麗君 呂雙飛 任慧杰 曾東東 王 靜 孔翠蓮 高盛杰 錢瑞宣

(石河子大學 動物科技學院,新疆 石河子 832000)

單核細胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)是引起人類與多種動物李斯特菌病的食源性人畜共患病原體,可穿越腸道屏障,血腦屏障和胎盤屏障[1-2]。李斯特菌病主要影響孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷者,并且呈現為危及生命的疾病,如母嬰李斯特菌病、敗血癥和腦膜腦炎[1-2]。每年由已知食源性病原體引起的死亡中有28%是由李斯特菌引起的[3],且LM引起的食物中毒導致患者死亡率高達30%[4]。目前WHO將其列為21世紀四大食源性致病菌之一,對公共衛生安全造成了較大危害[5]。

與LM致病力密切相關的毒力島(Listeriapathogenicity island, LIPI)包括LIPI-1、LIPI-2、LIPI-3和LIPI-4。其中LIPI-1與LM的胞內感染相關,主要由prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB6個毒力基因組成[6]。LIPI-2與LM的黏附、侵襲有關,由inlA、inlB和inlC等多個內化素基因組成[7]。LIPI-3可編碼李斯特菌溶血素S,與LM的細胞毒性和溶血性相關[8]。2016年 Maury等[9]發現LIPI-4是一個高毒力基因簇,最先被認為是CC4克隆群的LIPI-4為第一個與神經系統感染和母胎感染特異性關聯的LM毒力因子,但是近兩年來發現ST87和ST213等非CC4克隆群分離株都含有LIPI-4的特異基因[10-11]。該毒力島包含6個基因,分別編碼麥芽糖-6′-磷酸葡萄糖苷酶、抗轉錄終止子、與PTS系統相關的未知蛋白、EIIA、EIIB和EIIC[12-13],其本質上是一個纖維二糖家族磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate,PEP)磷酸轉移酶系統(Phosphotransferase system,PTS)。有研究表明,PTS糖特異性組分EII不僅能夠響應糖的運輸,還影響細菌毒力基因的表達[14-16]。Aké等[17]發現LM甘露糖-PTS的EIIAB缺失株毒力基因轉錄水平的上調依賴于PrfA的表達,同時PrfA的活性和毒力基因表達與EII的去磷酸化的水平負相關。因此,研究LIPI-4EII以揭示LM的致病機制是很有必要的。阮婷玉等[18]研究表明LIPI-4的缺失大大降低了對永生化人腦微血管內皮細胞(Human cerebral microvascular endothelial cells,HCMEC/D3)的侵襲和胞間傳播能力,進而影響LM的毒力。而LIPI-4作為LM中最新發現的毒力島,EII在LIPI-4參與LM致病性機制中發揮的作用尚不清楚。

本研究通過同源重組技術構建LIPI-4中EII(EIIA、EIIB和EIIC)的缺失株、強啟動子回補株和天然啟動子回補株,研究其對關鍵毒力因子轉錄水平及胞內增殖能力的影響,以此來研究EII對LM毒力因子的調控作用,為深入解析LIPI-4在LM感染宿主過程中的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和細胞

LM928由本實驗室分離、鑒定及保存;大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司;pMD19-T(simple)質粒載體購自大連TaKaRa公司;溫度敏感型穿梭質粒pKSV7由浙江大學動物科學學院提供;整合型質粒pIMK2由揚州大學生物科學與技術學院殷月蘭教授惠贈;永生化人腦微血管內皮細胞(HCMEC/D3)購自北京北納創聯生物技術研究院。

1.2 培養基與主要試劑

腦心浸出液培養基(BHI)和LB培養基購自青島高科園海博生物技術有限公司;氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素和慶大霉素購自北京博奧拓達科技有限公司;限制性核酸內切酶(PstⅠ、SacⅠ和XhoⅠ)、高保真DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購自大連TaKaRa公司;DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和青鏈霉素(P/S)購自美國 Sciencell公司;PCR Mix、DL2 000 DNA Marker、質粒小提試劑盒和DNA凝膠產物純化試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;RNA提取試劑盒、PerfectStart Uni RT&PCR Kit和5K DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 引物設計

登錄NCBI搜索序列號(NC_003210.1)獲取Listeriamonocytogenesserotype 4b str. CLIP 80459全基因序列,搜索Gene ID(7703592、7703593和7703594)獲取EIIA、EIIB和EIIC基因序列。利用Primer Premier 5設計相關引物(表1)。其中VΔEII-F/R位于EII基因上游725 bp和下游708 bp,用于對EII基因缺失的驗證;CΔEII-Phelp-F/R為EII基因的擴增引物;CΔEII-Pnative-F/R為天然啟動子與EII基因的擴增引物,其中Pnative為在EII基因上游序列中利用Softberry在線預測的天然啟動子。將引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 本研究中所用PCR引物

1.4 EII基因缺失株的構建

根據李紅歡[19]方法制備LM928感受態細胞。以LM928基因組為模板,PCR擴增EII基因的上下游同源臂,將電泳凝膠產物純化后經SOE-PCR獲得融合片段,4 ℃過夜連接至pMD19-T(simple)并測序,重組質粒pMD19-T-ΔEII圖譜如圖1(a),將測序正確的重組質粒pMD19-T-ΔEII與pKSV7在37 ℃經PstⅠ和EcoRⅠ雙酶切3 h,4 ℃過夜連接,連接產物轉化至大腸桿菌DH5α,涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養基,利用引物ΔEIIup-F和ΔEIIdown-R篩選陽性轉化子,再經雙酶切鑒定正確的重組質粒pKSV7-ΔEII電擊轉化入LM928感受態細胞中,重組質粒pKSV7-ΔEII圖譜如圖1(b),陽性電轉子接種于含有氯霉素的BHI液體培養基中,120 r/min,42 ℃振蕩培養,每隔5代用引物VΔEII-F/R檢測同源重組情況,篩選缺失株。缺失株在無氯霉素和30 ℃的條件下120 r/min震蕩培養,以消除pKSV7-ΔEII質粒。每隔5代利用引物VΔEII-F/R進行遺傳穩定性的檢測,將PCR產物純化回收后測序,測序正確的缺失株命名為LM928ΔEII。

圖1 重組質粒pMD19-T-ΔEII(a)、pKSV7-ΔEII(b)、pIMK2-EII(c)和pIMK2-EII-Pnative(d)質粒圖譜

1.5 EII基因回補株的構建

利用引物CΔEII-Phelp-F/R擴增EII基因,與pIMK2經PstⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接,利用引物CΔEII-Pnative-F/R擴增的EII-Pnative基因,pIMK2經SacⅠ和XhoⅠ雙酶切切除了自身的Phelp,再與雙酶切的EII-Pnative基因連接,連接產物轉化至大腸桿菌DH5α,大腸桿菌轉化子用引物EII-F/R與CΔEII-Pnative-F/R驗證,得到重組回補質粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-Pnative,重組回補質粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-Pnative圖譜如圖1(c)～(d),電轉入LM928ΔEII感受態細胞中,經PCR篩選的陽性電轉子接種于含有卡那霉素的BHI液體培養基中振蕩培養,經PCR與雙酶切驗證后送測序。測序正確的強啟動子回補株命名為CLM928ΔEII-Phelp,天然啟動子回補株命名為CLM928ΔEII-Pnative。

1.6 EII基因缺失株及回補株體外生長曲線的測定

將LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative分別劃線,37 ℃靜置培養后挑取單菌落于BHI液體培養基在37 ℃和160 r/min的條件下振蕩培養12～14 h至OD600值為0.8,細菌懸液按照1∶100的比例接種于20 mL的BHI液體培養基,記為0 h,且此時4個菌株OD600數值一致,此后每隔2 h吸取樣品至96孔板并設置3個平行,酶標儀讀取OD600數值,直至OD600數值趨于穩定。以時間為橫坐標,OD600數值為縱坐標,繪制4株菌株的生長曲線。

1.7 EII基因缺失株及回補株在HCMEC/D3細胞內增殖試驗

將HCMEC/D3傳代至12孔板中,待細胞融合至90%時(細胞數量約為 5×105個/孔),PBS洗滌3次,LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative以感染復數MOI=10感染HCMEC/D3(每組3個平行),感染1 h后更換含有慶大霉素(100 μg/mL)的DMEM培養基以殺死胞外細菌,此時記為0 h,1 h時后更換為含慶大霉素(10 μg/mL)的DMEM培養基繼續培養,分別在2、4、6、8、10和12 h使用PBS洗滌,加入胰酶消化,加入0.02%TritonX-100吹打收集樣品,10倍梯度倍比稀釋后涂布于BHI固體培養基,37 ℃靜置培養24 h,菌落計數后分析數據。

1.8 RT-qPCR檢測EII的表達以及毒力基因轉錄水平的比較

1.8.1RT-qPCR檢測體外EII基因及關鍵毒力基因的表達

挑取LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative劃線后的單菌落于液體BHI中振蕩培養14 h,8 000 r/min,4 ℃離心5 min,收集20 mL菌液,PBS清洗一次,收集的菌液使用液氮研磨,按照細菌總RNA抽提試劑盒進行野生株、缺失株與回補株的總RNA提取,反轉錄為cDNA,以cDNA為模板,使用PerfectStart Uni RT&PCR Kit檢測EII基因及關鍵毒力基因(prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB、inlA、inlB和inlC)轉錄水平,收集數據后采用相對定量方法(2-ΔΔCt)分析并使用GraphPad Prism軟件進行作圖。相關毒力基因以及內參gyrB的基因引物序列見表2。

表2 本研究中所用RT-qPCR引物信息

1.8.2RT-qPCR檢測HCMEC/D3細胞內LM關鍵毒力基因的表達

培養傳代細胞至75 cm2培養瓶中,待細胞融合至90%時(細胞數量約為1×107個/瓶),按照1.7的方法感染細胞(每組3個平行),12 h后用PBS收集細胞,再按照1.8.1的方法進行RT-qPCR試驗及數據分析。

1.9 數據統計及分析

采用SPSS 26.0統計學軟件,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異顯著,具有統計學意義;P<0.01表示差異極顯著,具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 EII基因缺失株及回補株的構建

經PCR擴增出EII基因上、下游同源臂,大小為526和411 bp,經SOE-PCR融合上、下游同源臂,大小為937 bp(圖2(a))。將融合片段ΔEII與pKSV7連接,經雙酶切驗證,獲得937 bp的ΔEII和7 096 bp的pKSV7條帶,表明重組質粒pKSV7-ΔEII構建成功(圖2(b))。重組質粒電轉入LM928感受態細胞,PCR鑒定出大小為937 bp的ΔEII條帶(圖2(c)),同源重組過程中使用引物VΔEII-F/R檢測出大小為1 433 bp的單一短條帶,表明缺失株LM928ΔEII構建成功,繼續傳20代,每隔5代均檢測出大小1 433 bp的單一條帶,表明LM928ΔEII具有良好的遺傳穩定性(圖2(d))。重組回補質粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-Pnative電轉入LM928ΔEII感受態細胞中,使用引物EII-F/R與CΔEII-Pnative-F/R篩選出大小為1 993 bp和2 524 bp的陽性電轉子。此結果表明CLM928ΔEII-Phelp與CLM928ΔEII-Pnative構建成功(圖2(e))。

(a)EII上、下游臂同源臂的擴增及同源臂SOE-PCR的擴增;(b)重組質粒pKSV7-ΔEII的雙酶切鑒定;(c)重組質粒pKSV7-ΔEII陽性電轉子的檢測;(d)EII基因缺失株的驗證及其遺傳穩定性檢測;(e)EII基因回補株的鑒定;M1:DL2 000 DNA Marker;M2:Trans 5K DNA Marker。 (a) EII gene upstream and downstream homologous arms and homologous arm SOE-PCR amplification; (b) Identification of recombinant plasmid PKSV7-ΔEII by double digestion; (c) Electroporation positive transformant PCR identification; (d) Verification and stability test of LM928ΔEII; (e) PCR identification of EII complemented strains; M1: DL2 000 DNA Marker; M2: Trans 5K DNA Marker.

2.2 EII基因缺失株及回補株體外生長曲線的測定

在BHI培養基中37 ℃培養的LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative在生長遲緩期、快速生長的對數期和生長平臺期生長趨勢均無較大差異(圖3)。此結果表明EII基因對LM928體外的生長特性無顯著影響。

圖3 EII基因缺失株及回補株生長曲線測定

2.3 EII基因缺失株及回補株在HCMEC/D3細胞內增殖的測定

使用LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative感染HCMEC/D3,在2、4、6、8、10和12 h收集樣品,涂布于BHI固體培養基,37 ℃靜置培養24 h,菌落計數。結果顯示,LM928ΔEII在8和12 h的細菌載量顯著高于LM928(P<0.05),在2和4 h的細菌載量極顯著高于LM928(P<0.01);CLM928ΔEII-Phelp在2、4、6、8、10和12 h的細菌載量比LM928極顯著降低(P<0.01);CLM928ΔEII-Pnative在2、4和6 h的細菌載量與LM928無顯著差異(P>0.05),在8、10和12 h的細菌載量比LM928極顯著降低(P<0.01)(圖4)。結果表明EII的缺失使LM928在HCMEC/D3中增殖的細菌載量升高,CLM928ΔEII-Phelp在胞內增殖方面未能恢復至LM928水平,而CLM928ΔEII-Pnative在2、4和6 h恢復到了LM928水平。

*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),ns表示差異不顯著。 * means significant difference (P<0.05), ** means extremely significant difference (P<0.01), ns means no significant difference (P>0.05).

2.4 EII對細菌關鍵毒力基因轉錄水平的影響

2.4.1RT-qPCR檢測細菌EII基因在BHI中的表達提取BHI中振蕩培養的LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative的總RNA,采用RT-qPCR方法研究EII基因的表達情況,數據經2-ΔΔCt法分析后作圖。結果顯示,LM928ΔEII中EII基因相對表達量趨近于0;CLM928ΔEII-Phelp將EII基因極顯著表達(P<0.01),其表達量為野生株的9.83倍;CLM928ΔEII-Pnative中EII基因表達與野生株無顯著差異(P>0.05)。結果表明LM928ΔEII中EII缺失完全,CLM928ΔEII-Phelp中EII基因過表達,CLM928ΔEII-Pnative中EII恢復至野生株水平(圖5(a))。

*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),ns表示差異不顯著。 * means significant differences (P<0.05), ** means extremely significant differences (P<0.01), ns means no significant differences (P>0.05).

2.4.2RT-qPCR檢測細菌在體外培養條件下關鍵毒力基因的轉錄水平

提取BHI中振蕩培養的LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative的總RNA,采用RT-qPCR方法研究EII基因對關鍵毒力基因的轉錄調控,數據經2-ΔΔCt法分析并作圖。結果顯示,EII基因的缺失使毒力基因plcA、hly、mpl、actA、plcB和inlC極顯著上調(P<0.01),prfA、inlA和inlB基因無顯著差異(P>0.05)。CLM928ΔEII-Phelp將66.7%(6/9)的基因較野生株表達極顯著上升1～4倍(P<0.01),CLM928ΔEII-Pnative使88.9%(8/9)的基因轉錄水平倍數變化在1倍以內(P<0.01)(圖5(b))。結果表明,在BHI中,EII與毒力基因plcA、hly、mpl、actA、plcB和inlC轉錄水平存在負調控關系,CLM928ΔEII-Phelp與CLM928ΔEII-Pnative均有部分基因表達未恢復至野生株水平。

2.4.3RT-qPCR檢測細菌關鍵毒力基因在HCMEC/D3細胞內的轉錄水平

使用LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative感染HCMEC/D3,在第12 h收集樣品,提取總RNA,采用RT-qPCR方法研究EII基因對關鍵毒力基因的轉錄調控。結果顯示,EII的缺失使毒力基因prfA、plcA、actA、plcB、inlB、inlC極顯著上調(P<0.01),mpl、inlA極顯著下調(P<0.01),hly無明顯差異(P>0.05)。CLM928ΔEII-Phelp使33.3%(3/9)的基因較LM928極顯著上調1～3倍(P<0.01),其中actA上調2.84倍。CLM928ΔEII-Pnative中基因轉錄水平變化均在1倍以內(圖5(c))。結果表明EII與毒力基因prfA、plcA、actA、plcB、inlB和inlC轉錄水平存在負調控關系,CLM928ΔEII-Phelp有部分基因表達未恢復至野生株水平,CLM928ΔEII-Pnative基因表達基本恢復至野生株水平。

3 討 論

LM是一種革蘭氏陽性土壤細菌,是食源性李斯特菌病的病原體。為了利用腐爛植物和其他生物在土壤中產生的大量碳源,LM擁有大量的碳水化合物轉運蛋白[20],其中許多屬于PTS。LM共有86個PTS基因,編碼29個完整的碳水化合物和糖醇轉運PTS,以及多個可能支持化合物轉運的單一PTS組分[21]。LIPI-4是一個2016年發現的高毒力基因簇,屬于纖維二糖家族PTS[9]。PTS糖特異性轉運組分EII除了在糖運輸和代謝中的能量互連和信號轉導的多功能性,以響應糖的可用性的固有作用外,還與細菌氧化應激、金屬離子穩態、耐藥性和毒力有關[14-16,22-23]。如甘露糖-PTS的EII(t),在下調LM毒力基因的表達中扮演重要角色[14],在肺炎克雷伯菌中,果糖-PTS中編碼EIIC的frwC基因也影響細菌的生成、超黏表型及毒力[23],羅非魚無乳鏈球菌纖維二糖-PTS的EIIB蛋白能夠負調控弱毒菌株的毒力[24]。有研究發現LM生長在葡萄糖、纖維二糖和果糖等高效代謝碳源上,EII可以抑制PrfA的活性,導致細菌毒力的下降[20,25]。到目前為止,介導纖維二糖和葡萄糖攝取的EII對PrfA活性的抑制最強,而介導甘露糖或果糖攝取的EII對PrfA活性的抑制較弱[25-27]。EII對PrfA活性的抑制作用似乎存在一個層級關系[28],在磷酸化級聯反應中,參與碳水化合物運輸的EII將磷酸基團轉移給輸入的碳水化合物,導致去磷酸化的EII水平升高,從而抑制PrfA的活性和LM毒力的表達。

本研究構建了LM928菌株LIPI-4中EII基因的缺失株、強啟動子回補株以及天然啟動子回補株。生長曲線表明EII的缺失與過表達對LM928在BHI中的生長曲線無影響。但在BHI培養條件下,EII的缺失使依賴PrfA轉錄的hly、plcA、plcB、actA和mpl的轉錄水平表現出極顯著的上調,但介導LM毒力基因表達的主調控因子prfA的轉錄水平無顯著差異。Stoll等[21]發現PrfA在BHI培養的LM中檢測出較低的活性,而在哺乳動物宿主細胞內培養的LM中檢測出較高的活性,因此本研究通過感染HCMEC/D3得到了LM在細胞水平上毒力基因的轉錄水平,缺失EII后,毒力基因prfA、plcA、plcB、inlB、inlC和actA的轉錄水平極顯著上調,與Stoll一致,其中actA的轉錄水平嚴格依賴于PrfA的調控[29],prfA上調了0.20倍,actA卻上調了2.34倍,這與Joseph等[28]報道的prfA轉錄水平的小幅升高能夠導致依賴于PrfA轉錄的毒力基因轉錄水平的大幅增加結果一致。由PrfA調控的基因其蛋白表達能力的大小隨著PrfA調控子的濃度和其與啟動子親和性的不同而不同,對于hly、mpl和inlAB,盡管它們都受到PrfA的調控,但是由于啟動子對RNA聚合酶的親和力以及5′非翻譯區結構的不同可能會引起這些依賴于PrfA的基因表達水平不同[6]。這可能是本研究中毒力基因hly、mpl和inlA的轉錄水平未表現出隨著prfA表達的升高而升高的原因。在胞內增殖試驗中,缺失EII使LM在HCMEC/D3中的細菌數量升高,這與EII缺失使LM內化進入非吞噬細胞系的關鍵基因(inlB),參與吞噬體液泡逃逸的基因(plcA和plcB)和參與細胞間傳播的基因(actA和inlC)轉錄水平的上調結果相一致。LIPI-4的EII抑制prfA的表達,調控關鍵毒力因子的轉錄水平,這與介導纖維二糖和葡萄糖攝取的EII抑制PrfA活性結果[25]一致。EII的缺失使LM關鍵毒力基因表達上升,這促進了LM進入細胞以及在細胞內的增殖,但對于LM在體外的生長影響無顯著差異,這導致了LM在體外與細胞內的增殖情況有所差異。

Monk等[30]構建了整合型LM載體pIMK2,其自身攜帶的強啟動子會提高基因表達的總體水平,pIMK2現已被廣泛用于LM回補株的構建。但本研究結果表明CLM928ΔEII-Phelp與LM928的水平差異較大,可能是強啟動子使EII的過量表達造成了試驗結果的不穩定,表明利用載體提供的強啟動子構建回補株可能達不到對缺失株功能補充驗證的目的。有研究構建了LM毒力基因的天然啟動子回補株,在生化特性與細胞試驗中恢復到了野生株的水平[31]。于是本研究選擇構建天然啟動子回補株,使用生物信息網站Softberry預測EII基因上游非編碼區的自身啟動子,根據啟動子與轉錄因子結合的順式元件基序的打分情況,選擇了轉錄起始位點到其上游531 bp的區域作為天然啟動子區域,其中包含了兩個預測到的啟動子,一是位于轉錄起始位點上游35 bp的核心啟動子,包含了兩個能決定開啟下游基因轉錄的RNA聚合酶sigma因子RpoD17(結合位點為ATTTTGTA和TTTTGTAT)和RpoD18(結合位點為AATTGAGG)的結合位點,還有一個介導細菌抵抗氧化應激作用的轉錄調控因子OxyR(結合位點為GATTAATT)和一個幾丁質酶與二糖酶的轉錄調控因子Nagc(結合位點為GAAATAAG)的結合位點;二是位于轉錄起始位點上游482 bp的近端啟動子,包含硝酸鹽應答轉錄調節因子NarL(結合位點為TGCTCCTT)的結合位點。

RT-qPCR結果顯示,強啟動子將EII過表達,其轉錄水平上升9.83倍,提示其可作為過表達株研究EII基因,而天然啟動子將EII的表達恢復至野生株水平。在缺失EII后,毒力基因表達顯著上調,而CLM928ΔEII-Pnative則可以將這些基因恢復或部分恢復,說明EII是LIPI-4中重要的毒力相關基因;有意思的是,當EII基因過表達后,與野生株相比,除了inlA以外,其他毒力基因也全部上調,這一方面進一步確定了EII基因參與LM的毒力調控。另一方面,EII可能具有直接平衡或控制毒力的能力:EII表達量過低(缺失條件下),解除對PrfA的抑制,直接調控毒力因子轉錄水平的上升;但當EII表達量過高時(過表達),降低了透性酶在膜上的定位,且EII過量表達后,產生復雜的產物,導致EII基因甲基化,EII的活性被抑制,從而解除了EII對PrfA活性的抑制,導致毒力基因表達的升高,這也可能是過表達回補株與缺失株毒力基因轉錄水平相近的原因。在體外和細胞內的培養下,CLM928ΔEII-Pnative的毒力基因轉錄水平基本恢復至野生株水平,這與天然啟動子將EII的表達恢復至野生株水平一致,而actA等基因的轉錄水平沒有恢復至野生株水平可能是因為本研究構建的天然啟動子只選擇了核心啟動子和近端啟動子,沒有包含的遠端啟動子也可能影響了毒力因子的表達。胞內增殖試驗中,CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative都表現出了增殖的下降,可能是由于外源質粒的插入,LM減少增殖來維持質粒的復制所導致的。以上提示,CLM928ΔEII-Pnative更適合作為陽性對照株用于對LM928缺失株功能的補充驗證。

本研究只局限于體外試驗,后續不僅要研究EII對HCMEC/D3細胞通透性的影響,還需要以小鼠為模型進行感染試驗,通過體內實驗對EII與LM之間的致病機制進行研究。

4 結 論

本研究構建EII缺失株、強啟動子回補株和天然啟動子回補株,通過胞內增殖實驗和檢測體外與細胞內的毒力因子轉錄水平以深入了解EII對LM毒力基因表達的影響,結果表明LIPI-4EII對LM關鍵毒力因子的轉錄具有負調控作用。本研究為進一步探究LM LIPI-4致病機理提供相關的理論依據。