腹腔注射α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺對小鼠肺恒定自然殺傷T細胞及亞群的影響

彭楠，張景楠，陳俊玉，滕景芳，孟明，曹彩霞，王彥

作者單位：1河北大學臨床醫(yī)學院、河北大學附屬醫(yī)院檢驗科，河北 保定 071000；

2河北大學基礎醫(yī)學院，河北 保定 071000；

3保定市中心血站，河北 保定 071000

恒定自然殺傷T 細胞（invariant nature kiler T cell，iNKT）是T 淋巴細胞中一個獨特的亞群，可識別 CD1d 分子呈遞的脂類抗原。活化后分泌多種細胞因子，直接或間接參與各項機體免疫反應［1］。iNKT 細胞在胸腺中分化成不同的亞群，包括iNKT1［主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）］、iNKT2［主要分泌白細胞介素-4（IL-4）］、iNKT17［主要分泌白細胞介素-17A（IL-17A）］［2］。最新研究證明，特異性激活iNKT 細胞亞群，可以更有效地發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)和治療的作用，在感染、腫瘤等疾病中，我們希望iNKT細胞產(chǎn)生促炎性因子的作用，而在自身免疫性疾病時，我們更希望激活iNKT 細胞的抗炎性免疫反應［3-4］。α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺（α-GalCer ）是iNKT 細胞特異性激活劑，是已知的最有效的iNKT細胞選擇性抗原［5］。但是大劑量的α-GalCer 刺激，會使iNKT細胞在數(shù)月內(nèi)進入免疫失能狀態(tài)，對后續(xù)的抗原刺激反應減弱或無應答［6］。

在小鼠肺中，iNKT 細胞在肺脈管系統(tǒng)和間質(zhì)組織間建立了非循環(huán)群體［7］。大多數(shù) iNKT1 和iNKT2細胞存在于脈管系統(tǒng)中，iNKT17 細胞主要存在于組織間質(zhì)［8-9］。呼吸系統(tǒng)的免疫系統(tǒng)承受著巨大的負荷和種類繁多的外來抗原，引發(fā)多種免疫反應［10］。因此研究腹腔注射α-GalCer對小鼠肺iNKT細胞、細胞亞群及外周血細胞因子的影響，觀察其動態(tài)變化，從而為后續(xù)獲得臨床免疫細胞治療提供基礎研究數(shù)據(jù)，同時也可為疫苗的研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物6~8 周齡的雄性C57BL/6J 小鼠，引入SPF 級動物室后，進行1周適應性飼養(yǎng)，隨后進行實驗。該實驗已通過河北大學動物福利倫理委員會的批準且在操作過程中嚴格遵守《實驗動物保護條例》。

1.1.2 主要試劑與儀器α-GalCer（北京Adipo?Gen）；戊巴比妥鈉、小鼠組織淋巴細胞分離液、0.5 mol/L EDTA（北京索萊寶）；Foxp3/Transcription Fac?tor Staining Buffer（美國Invitrogen）；FITC Hamster Anti-Mouse TCR-β Chain、AlexaFluor?647-mouse an?ti-PLZF、BV421 Mouse Anti-Mouse RORγt 、PE-Cy?7 Mouse Anti-T-bet（美國BD）；T-selected-CD1d tetra?mer-PE（日本MBL）；Mouse-IFN-γ ELISA、Mouse-IL-4 ELISA、Mouse-IL-17A ELISA（聯(lián)科生物，杭州）。Olympus-Ⅱ光學顯微鏡（日本，Olympus）；流式細胞儀FACSCantoII（美國，BD Pharmingen ）；酶標儀（美國，Bio-tek EPOCH）；低溫高速離心機（美國，Beck?man公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠模型制備及干預C57BL/6 小鼠，雄性，每只體質(zhì)量（20±2）g，采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組和α-GalCer 干預組，每組30 只，α-GalCer 干預組每克體質(zhì)量注射α-GalCer 100 ng，正常對照組注射同等體積的生理鹽水。于小鼠腹腔注射α-Gal?cer 2、4、6、8、10 d 后，檢測各組小鼠肺內(nèi)iNKT 細胞及亞群的變化；在2、6、8 d 后檢測小鼠外周血細胞因子的變化。

1.2.2 標本的獲取與處理腹腔注射1%的苯巴比妥鈉鹽（50 mg/kg）對小鼠麻醉后進行眼球取血，12 000 r/min，4 ℃離心8 min，收集上清轉至EP 管中，?80 ℃冰箱低溫保存用于ELISA 檢測。隨后脫頸椎處死小鼠，用外科剪及鑷子獲取小鼠的肺組織，小鼠肺臟于浸潤冰PBS緩沖液的細胞篩上剪碎、研磨獲取單細胞懸液。細胞經(jīng)PBS 洗滌離心2 次，1 000 r/min，4 ℃離心5 min 獲取細胞沉淀。重懸后過淋巴細胞分離液，再次經(jīng)PBS 洗滌離心2 次，棄上清后獲取單細胞懸液。

1.2.3 小鼠外周血血清細胞因子的檢測提前將試劑及樣本平衡至室溫并確定所需的酶標板孔數(shù)，按照ELISA 試劑盒說明書規(guī)范操作，檢測小鼠血清IFN-γ、IL-4和IL-17A 的表達水平。

1.2.4 肺淋巴細胞中iNKT 頻率檢測收集“1.2.2”獲取的單細胞懸液于流式管中，每管106個細胞，加入1 μL FITC Hamster Anti-Mouse TCR-β Chain 和1μL PE 標記的負載α-GalCer 的CD1d 四聚體（PE-α-GalCer/CD1d-tetramer），渦旋混勻4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗2次后用500 μL 4 ℃的PBS重懸細胞，吹打混勻經(jīng)流式細胞儀檢測iNKT（TCR-β+α-GalCer/CD1d-tetramer+）細胞頻率。α-GalCer/CD1d-tetramer為本實驗室配制：采用體積分數(shù)為0.5%的吐溫?20 和質(zhì)量分數(shù)為0.9%的生理鹽水將濃度為1 g/L的α-GalCer 貯存液稀釋至200 mg/L，隨后將5 μL 稀釋液加入到100 μL CD1d-tetramer 中，混勻，室溫過夜負載18~20 h后于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 肺iNKT1、iNKT2、iNKT17 亞群頻率檢測同上述1.2.4 小節(jié)所述，加入FITC Hamster Anti-Mouse TCR-β Chain 和PE-α-GalCer/CD1d-tetramer 對分離的淋巴細胞進行表染，PBS 清洗2 次后，按照Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer 試劑盒說明書對細胞進行透化固定處理，進行亞群檢測。每支流式管中加入1 mL 透化固定液于4 ℃避光透化固定45 min；加入1 mL 1×破膜緩沖液使偶聯(lián)熒光素的抗體充分進入細胞，500g，4 ℃離心5 min；棄上清后加入AlexaFluor?647-mouse anti-PLZF、BV421 Mouse Anti-Mouse RORγt、PE/Cyanine7 Mouse Anti-T-bet 各1μL，吹打混勻后4 ℃避光孵育30 min，每管加入1×破膜緩沖液1 mL，500g，4 ℃離心5 min。棄上清后用500 μL 4 ℃的PBS 重懸細胞，吹打混勻后上機檢測iNKT 細胞亞群頻率。在淋巴細胞群中以TCR-β+α-GalCer/CD1d-tetramer+雙陽性細胞群為iNKT 細胞。在iNKT 細胞群中，以T-bet+PLZF-為iNKT1 亞群，T-bet-PLZF+為iNKT2 亞群，RORγt+PLZF-為iNKT17亞群。

1.3 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)應用SPSS 24.0 進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)以表示，兩組不同時間點之間比較采用重復測量數(shù)據(jù)方差分析，同組內(nèi)不同時間點的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠肺臟iNKT細胞頻率及亞群的變化

2.1.1 iNKT 細胞頻率重復測量數(shù)據(jù)的方差分析結果顯示，組別因素（F=12.61，P<0.001）和時間因素（F=233.41，P<0.001）對iNKT 細胞頻率均有影響，且兩者之間存在交互作用（F=195.53，P<0.001）。組內(nèi)分析結果顯示，對照組iNKT細胞頻率在各時間點差異無統(tǒng)計學意義；α-GalCer干預組iNKT 細胞頻率在第4、6、8、10 天明顯時明顯低于第2 天（P<0.05）；組間分析結果顯示，α-GalCer干預組iNKT 細胞頻率在第2 天時高于對照組，第6、8、10 天時低于對照組（P<0.05）。見表1。

表1 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細胞頻率變化/（%，）

表1 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細胞頻率變化/（%，）

注：①與第2天相比，P<0.05。②與對照組相比，P<0.05。

?

2.1.2 iNKT1亞群細胞頻率重復測量數(shù)據(jù)的方差分析結果顯示，組別因素（F=176.04，P<0.001）和時間因素（F=16.41，P<0.001）對iNKT1 亞群細胞頻率均有影響，且兩者之間存在交互作用（F=19.70，P<0.001）。組內(nèi)分析結果顯示，對照組iNKT1 亞群細胞頻率在各時間點差異無統(tǒng)計學意義；α-GalCer 干預組iNKT1 細胞頻率在第4、6、8、10 天明顯時明顯低于第2 天（P<0.05）；組間分析結果顯示，α-GalCer干預組iNKT1 亞群細胞頻率在第2、4、6、8、10 天時均低于對照組（P<0.05）。見表2。

表2 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細胞1亞群細胞頻率變化/（%，）

表2 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細胞1亞群細胞頻率變化/（%，）

注：①與第2天相比，P<0.05。②與對照組相比，P<0.05。

?

2.1.3 iNKT2亞群細胞頻率重復測量數(shù)據(jù)的方差分析結果顯示，組別因素（F=108.13，P<0.001）和時間因素（F=92.97，P<0.001）對iNKT2 細胞頻率均有影響，且兩者之間存在交互作用（F=92.93，P<0.001）。組內(nèi)分析結果顯示，對照組iNKT2 細胞頻率在各時間點差異無統(tǒng)計學意義；α-GalCer 干預組iNKT 細胞頻率在第4、6、8、10 天明顯時明顯高于第2 天（P<0.05）；組間分析結果顯示，α-GalCer 干預組iNKT 細胞頻率在第2、4、6、8、10 天時均高于對照組（P<0.05）。見表3。

表3 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細胞2亞群細胞頻率變化/（%，）

表3 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細胞2亞群細胞頻率變化/（%，）

注：①與第2天相比，P<0.05。②與對照組相比，P<0.05。

?

2.1.4 iNKT17 亞群細胞頻率重復測量數(shù)據(jù)的方差分析結果顯示，組別因素（F=8.21，P=0.001）和時間因素（F=43.29，P<0.001）對iNKT17 細胞頻率均有影響，且兩者之間存在交互作用（F=38.72，P<0.001）。組內(nèi)分析結果顯示，對照組iNKT17 細胞頻率在各時間點的差異不大；α-GalCer干預組iNKT 細胞頻率在第4、6、8、10 天明顯時明顯高第2 天（P<0.05）；組間分析結果顯示α-GalCer 干預組iNKT 細胞頻率在第2 天時均低于對照組，第4、8 天高于對照組（P<0.05）。見表4。

表4 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細胞17亞群細胞頻率變化/（%，）

表4 小鼠肺臟恒定自然殺傷T細胞17亞群細胞頻率變化/（%，）

注：①與第2天相比，P<0.05。②與對照組相比，P<0.05。

?

2.2 腹腔注射α-GalCer 后不同時間引發(fā)血清中細胞因子的變化重復測量數(shù)據(jù)的方差分析結果顯示，組別因素（F=95.95、10.29、64.29，P<0.001、0.003、<0.001）和時間因素（F=546.35、6.33、14.87，P<0.001、0.006、<0.001）對IFN-γ、IL-4、IL-17A 水平均有影響，且兩者之間存在交互作用（F=5.87、26.68、3.43，P=0.007、<0.001、0.046）。組內(nèi)分析結果顯示，對照組第6 天和第8 天的IFN-γ 水平低于第2 天，第6天的IL-4水平高于第2天，第6天的IL-17A 水平低于第2 天；α-GalCer 干預組第6 天和第8 天的IFN-γ和IL-4 水平低于第2 天，第6 天的IL-17A 水平低于第2 天；均差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。組間分析結果顯示α-GalCer 干預組在第2 天時IFN-γ 和IL-4水平高于對照組，IL-17A 水平低于對照組；在第6天時IFN-γ 水平高于對照組，IL-4 和IL-17A 水平低于對照組；在第8 天時IFN-γ 水平高于對照組，IL-17A水平低于對照組；上述均差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表5。

表5 小鼠腹腔注射 α-GalCer后血清中細胞因子變化統(tǒng)計/（ng/L，）

表5 小鼠腹腔注射 α-GalCer后血清中細胞因子變化統(tǒng)計/（ng/L，）

注：α-GalCer為α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺，IFN-γ為干擾素-γ，IL-4為白細胞介素-4，IL-17A為白細胞介素-17A。①與第2天相比，P<0.05。②與對照組相比，P<0.05。

?

3 討論

iNKT 細胞是連接先天性與適應性免疫反應的橋梁，其恒定的T 細胞受體識別MHC-Ⅰ類分子CD1d 呈遞的糖脂類抗原，從而導致細胞因子達到“爆炸性”效應反應［11］。微環(huán)境的改變也可以調(diào)節(jié)肺中iNKT 細胞穩(wěn)態(tài)［12］。iNKT 細胞活化后可分泌Th1型促炎（如IFN-γ）或Th2型抑炎細胞因子（IL-4）［13］。iNKT 細胞在肺組織中雖遠不如在肝臟中豐富，但其確實對于某些肺部疾病產(chǎn)生了深遠影響。例如iNKT 細胞反應迅速，因此在對呼吸道感染的反應中發(fā)揮關鍵作用［12］；有研究［14］表明iNKT細胞在介導氣道高反應性（AHR）中發(fā)揮作用。

α-GalCer 能夠與抗原提呈細胞表面CD1d 分子結合，提呈給iNKT 細胞表面的TCR 受體，從而激活iNKT 細胞，發(fā)揮致炎或抑炎作用，有文章［15-16］報道，腹腔注射抗原最容易被巨噬細胞所提呈。

研究［16］表明不同的組織中富含不同的 iNKT 細胞亞群，例如，在小鼠肝臟中iNKT1細胞亞群占主導地位，而iNKT17 細胞主要位于肺、淋巴結和皮膚中。iNKT2 細胞分布在肺和脾幾個部位，但它們在腸系膜淋巴結中的含量更為豐富［2］。本項研究數(shù)據(jù)中顯示，小鼠肺臟iNKT1 多于iNKT2，推測原因可能是由于腹腔注射過程中，藥物導致小鼠肺臟中微生物群發(fā)生改變［12］，具體原因還有待進一步探查。

有研究［17］表明，在基礎條件下的肺中，iNKT 細胞主要存在于脈管系統(tǒng)中，而一小部分存在于間質(zhì)中，我們與其所得結果結論一致，腹腔注射α-GalCer后，間質(zhì)中iNKT17 亞群頻率隨時間而升高，脈管系統(tǒng)中的iNKT1 亞群頻率明顯降低，說明在注入激活劑后，肺iNKT 細胞遷出脈管系統(tǒng)而進入間質(zhì)，這種行為有著有著很強的特異性。

通過對小鼠不同時間的動態(tài)觀察，我們可以發(fā)現(xiàn)，小鼠肺臟中iNKT 細胞頻率呈現(xiàn)前期（2 d）升高，后期降低的趨勢，我們推測是由于注射α-GalCer 2 d 后再取材檢測，已經(jīng)錯過了小鼠體內(nèi)肺iNKT 細胞頻率達到最大的時間，從而后續(xù)時間內(nèi)，iNKT 細胞頻率一直降低；小鼠肺臟中iNKT1 亞群頻率在腹腔注射α-GalCer 后一直處于下降的趨勢，其中第8天達到最低值（1.88±0.25）%，這可能是由于肺部的微環(huán)境限制了iNKT1 細胞亞群的增殖，或者已經(jīng)增殖的iNKT1 細胞遷至外周所致［11］；小鼠肺臟中iNKT2 亞群頻率一直處于上升的趨勢，其中第4 天達到最高值（21.83±0.61）%，這可能是由于正常機體內(nèi)iNKT1與iNKT2是一種平衡關系，二者此消彼長，當iNKT1 亞群頻率受到明顯抑制時，在α-GalCer 的刺激下，iNKT2 增長，維持機體的健康；小鼠肺臟中iNKT17 亞群頻率升高，文章表明β-連環(huán)蛋白調(diào)節(jié)iNKT 細胞分化為 iNKT2 和 iNKT17［18］。因此，可以在一定程度上說明兩種亞群有一定的相關性，對肺部炎癥可以產(chǎn)生一定的影響。

iNKT 細胞的免疫調(diào)節(jié)作用依賴于細胞因子的分泌，因此我們也做了相應小鼠外周血細胞因子的變化統(tǒng)計試驗，腹腔注射α-GalCer 后，IFN-γ 濃度一直處于上升的趨勢，其中，第2 天升高最明顯（500.45±7.68）ng/L，IFN-γ 主要是由iNKT1細胞產(chǎn)生的Th1 型細胞因子，因此我們推測，腹腔注射α-Gal?cer 以升高小鼠體內(nèi)iNKT1 亞群為主，已有研究報道，IFN-γ 會抑制外周血IL-4 的釋放［16］，但本研究顯示，第2 天IFN-γ 與IL-2 均呈升高趨勢，推測原因可能與腹腔注射α-GalCer 可以導致小鼠外周血中IL-10 水平增高有關［19］。IL-17A 被認為是炎癥反應的重要調(diào)節(jié)因子，研究表明小鼠注射α-GalCer 后會導致IL-17A 快速而穩(wěn)定地釋放到血液中［20］，而研究數(shù)據(jù)顯示IL-17A含量下降，其原因有待進一步研究。

綜上所述，腹腔注射α-GalCer 可以對肺部iNKT細胞及亞群的激活可以產(chǎn)生不同影響。iNKT 細胞不同亞群發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)與免疫治療作用是不同的，做此項研究可以為日后肺部相關疾病的細胞治療提供基礎性研究數(shù)據(jù)。同時外周血細胞因子的變化也進一步提示了腹腔注射α-GalCer 會影響機體的免疫功能。