阿托伐他汀鈣對脂多糖誘導急性肺損傷小鼠核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1通路的影響

李姍，王榮麗

作者單位：西南醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，四川 瀘州 646000

急性肺損傷（ALI）是一種由機體創傷、燒傷、重癥感染、休克、彌散性血管內凝血等因素觸發并以逐漸進展的呼吸困難、難以逆轉的氧合障礙、非心源性肺水腫為臨床特征［1］的危急重癥。急性呼吸窘迫綜合征是ALI 進展的嚴重階段，發病率及死亡率高［2］，至今仍然缺乏特效治療藥物。阿托伐他汀鈣（AVT）屬于3 羥基-3 甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶選擇性、競爭性抑制劑，除針對心血管系統調節血脂、抗動脈粥樣硬化外，還可抑制炎癥、調節氧化應激、調節免疫、改善內皮功能等［3-6］。已有文獻［7-8］報道，受核因子E2 相關因子2（Nrf2）調控的下游因子血紅素加氧酶1（HO-1）表達增強能抑制炎癥細胞如中性粒細胞、巨噬細胞等介導的炎癥反應，但AVT 是否也能通過該通路減輕脂多糖（LPS）誘導的ALI 小鼠炎癥反應仍需進一步驗證。研究時間2021年9―12月。

1 材料與方法

1.1 動物15 只4～6 周齡健康雌性BALB/c 小鼠，購自湖北省實驗動物研究中心，合格證號［SCXK（鄂）2020-0018］，體質量范圍為19～22 g。

1.2 藥品與試劑AVT（貨號A121956，規格250 mg，純度98%）；LPS（貨號L118716，規格10 mg，純度99%），均購自上海阿拉丁有限公司。小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（貨號ELK1395，規格96T）、白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒（貨號ELK1271，規格96T）均購自武漢科鹿生物科技有限公司；山羊抗兔二抗（貨號AS1107，規格100 μL）購自武漢阿斯本生物技術有限公司；Nrf2兔抗鼠抗體（貨號16396-1-AP，規格150 μL）購自武漢三鷹生物技術有限公司；HO-1 兔抗鼠抗體（貨號#43966，規格100 μL）購自美國CST公司。

1.3 儀器ABL700 全自動血氣分析儀，購自瑞士羅氏公司；RM2016 病理切片機，購自上海徠卡公司； DR-200Bs酶標儀，購自Diatek公司。

1.4 小鼠分組及建立ALI模型15只BALB/c 雌性小鼠采用隨機數字表法分為NS 組、LPS 組、LPS+AVT 組，每組5 只。LPS 組、LPS+AVT 組以尾靜脈注射 LPS 4 mg/kg構建ALI動物模型，NS組則以相同方式注射等量生理鹽水。小鼠出現精神萎靡、活動減少、呼吸急促、四肢及口唇發紺為模型建立成功。建模1 h 后，LPS+AVT 組予以 AVT 10 mg/kg灌胃，其余組分別以等量生理鹽水灌胃。建模后6 h 以水合氯醛腹腔麻醉小鼠，采集腹主動脈血1 mL，并用頸椎脫臼法處死。

1.5 測定動脈氧分壓（PaO2），計算氧合指數（PaO2/FiO2）比值取腹主動脈血1 mL，使用全自動血氣分析儀，檢測PaO2并計算PaO2/FiO2比值（呼吸空氣情況下吸入氧濃度FiO2為21%）。

1.6 肺組織HE 染色取出小鼠左肺組織，分別進行固定、脫水、包埋、切片、HE 染色，光鏡下觀察小鼠肺組織病理形態學改變。

1.7 肺組織濕干重（W/D）比值取出右肺中葉，稱重，測定濕質量（W）后置于85 ℃恒溫烘干箱中36 h，再稱重測出干質量（D），計算W/D比值。

1.8 肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β 檢測處死小鼠后鈍性分離出氣管，進行氣管插管，以1 mL 預冷生理鹽水灌洗、回抽，重復3 次。將回收后的灌洗液混勻，在冰凍離心機4 ℃下，以3 000 r/min 離心10 min，取出上清液，據TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β含量。

1.9 小鼠肺組織Nrf2、HO-1 蛋白檢測取各組小鼠右肺下葉組織，用BAC 法測定肺組織總蛋白濃度后，取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，PVDF膜恒流轉膜后室溫封閉，加入一抗Nrf2 抗體（稀釋比1∶500）、HO-1 抗體（稀釋比1∶2 000）、GAPDH 單克隆抗體（稀釋比1∶10 000）過夜。回收一抗，TBST 洗滌3次，然后室溫下孵育二抗（稀釋比1∶10 000），TBST洗滌4次。均勻滴加現配的ECL混合溶液（顯影液∶定影液=1∶1）到膜蛋白面側，據光強度不同調整曝光條件。用AlphaEaseFC 軟件掃描膠片，以目標帶與GAPDH 帶的光密度比值作為結果進行統計學分析。

1.10 統計學方法應用統計軟件SPSS 17.0，計量資料以表示，多組間比較用單因素方差分析，其中兩兩比較行LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠肺組織病理改變HE 染色可呈現小鼠因肺組織損傷而形成的病理學改變。如圖1，NS 組小鼠肺泡結構清晰度、完整度高，肺泡壁均一，肺間隔薄，肺泡腔干凈。LPS組小鼠肺泡結構混亂不清，肺泡壁不均勻，肺間隔變厚，肺泡腔及間隔里大量炎性細胞滲出堆積；LPS+ AVT組小鼠肺泡結構較清晰完整，肺泡壁也較均一，肺間隔輕度增厚，炎性滲出浸潤減少。

圖1 各組小鼠肺組織結構（HE×100和HE×400）

2.2 小鼠動脈血氣分析由檢測的小鼠PaO2水平了解肺部缺氧程度，并根據其數值計算PaO2/FiO2以評估其肺部呼吸功能急性損傷情況。如表1 顯示，LPS 組小鼠的PaO2、PaO2/FiO2均顯著低于NS 組（P<0.05），而LPS+AVT 組小鼠PaO2及PaO2/FiO2均高于LPS組（P<0.05）。

表1 小鼠動脈血PaO2、PaO2/FiO2和肺組織W/D比值/

表1 小鼠動脈血PaO2、PaO2/FiO2和肺組織W/D比值/

注：PaO2為動脈氧分壓，PaO2/FiO2為氧合指數，W/D為濕/干比值。①與NS組比較，P<0.05。②與LPS組比較，P<0.05。

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2.3 小鼠肺組織W/D 比值檢測小鼠肺組織W/D比值以評估肺部血管滲漏和肺組織水腫程度。如表1顯示，LPS組小鼠W/D比值高于NS組（P<0.05），而LPS+ AVT組小鼠W/D比值低于LPS組（P<0.05）。

2.4 小鼠BALF 中TNF-α 、IL-1β 水平采用ELI?SA 法檢測小鼠BAF IL-1β、TNF-α 的含量，以反映小鼠肺部炎癥水平。根據結果分析，LPS 組小鼠的TNF-α、IL-1β 水平均顯著高于NS 組（P<0.05），而LPS+AVT組小鼠上述炎性因子水平均明顯低于LPS組（P<0.05）。見表2。

表2 小鼠BALF IL-1β、TNF-α 水平及肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達比較/

表2 小鼠BALF IL-1β、TNF-α 水平及肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達比較/

注：BALF為肺泡灌洗液，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白介素-1β，Nrf2為核因子E2相關因子2，HO-1為血紅素加氧酶1。①與NS組比較，P<0.05。②與 LPS組比較，P<0.05。

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2.5 小鼠肺組織Nrf2、HO-1 蛋白表達比較通過蛋白質印跡法測定小鼠肺組織Nrf2、HO-1蛋白的表達水平，以評估Nrf2/HO-1 通路的激活或抑制狀態。經結果分析，LPS 組小鼠Nrf2、HO-1 表達水平均顯著低于NS 組（P<0.05），而LPS+AVT 組小鼠Nrf2、HO-1表達水平高于LPS組（P<0.05）。見表2，圖2。

圖2 各組小鼠肺組織中Nrf2、HO-1蛋白水平

3 討論

AVT 對HMG-CoA 還原酶起特異性抑制效應，通過阻礙HMG-CoA 向甲羥戊酸轉化實現調脂、抗動脈粥樣硬化作用。研究［9］發現AVT能下調黏附分子表達，降低促炎細胞因子及補體末端產物水平，減少核轉錄因子-κB p65磷酸化，抑制炎癥細胞浸潤和組織損傷。據黃興漢［10］研究，腦缺血再灌注后的大鼠經AVT 處理，其梗死灶周圍中性粒細胞較對照組明顯減少，表明AVT 可抑制臟器炎癥損傷中炎癥細胞的浸潤。為了驗證AVT對ALI小鼠發揮積極的炎癥保護作用并探索可能存在的新機制，我們開展了這個實驗，以期為AVT 在ALI 的應用提供更多的理論依據。

ALI 早期肺泡基底膜受損，肺微血管通透性增加，蛋白質、液體在肺間質聚集引起水腫，并向肺泡內滲漏［11］，隨后出現肺容積減少、順應性下降、通氣血流比例失調等眾多病理生理改變，進而導致以PaO2下降為主的急性呼吸功能衰竭。本研究采用LPS呈現ALI模型，可見ALI小鼠因肺間隔和肺泡腔內大量炎性細胞滲出堆積導致肺泡結構混亂不清，肺組織含量水高。并且，ALI 小鼠出現低氧血癥的同時，其動脈血氣分析的結果也符合ALI 的診斷標準，即PaO2/ FiO2≤300 mmHg［12］。上述結果均能說明此次LPS 誘導的小鼠ALI 模型是成功的。此外，研究結果還可見AVT的治療可以減輕ALI小鼠肺泡結構破壞程度，減少炎性細胞滲出堆積，降低肺組織含水量，改善肺部呼吸功能受損。

LPS 誘導的ALI 病情進展迅速，涉及炎癥、氧化應激、離子通道改變、細胞凋亡等多個環節［13-14］。IL-1β、TNF-α 均參與炎癥的級聯放大效應［15］。多形核白細胞作為主要的炎癥細胞，通過上調其表面的細胞黏附分子CD11/CD18、P-選擇素等，在肺內過度聚集、浸潤、活化，釋放許多具有生物損害作用的組織蛋白酶、TNF-α 等炎性物質。IL-1β、TNF-α 同時也具備促炎能力，當肺內巨噬細胞受到炎性或損傷刺激時也可分泌這兩種物質，以作用于多形核白細胞和其他炎癥細胞，促使更多的炎性介質和細胞因子產生、擴散，正反饋循環得到啟動，加重肺損傷［16］。我們的研究可見，LPS 誘導后的兩組小鼠肺泡灌洗液IL -1β、TNF-α 含量均高，提示炎癥反應得到啟動；而LPS+AVT組的小鼠IL -1β、TNF-α水平降低，提示炎癥反應有所抑制。因此，若能阻斷炎癥放大反應，也許能夠延緩ALI病情進展。

研究表明激活Nrf2/HO-1 通路在氧化應激、炎癥反應、組織損傷中具有積極作用［17-19］。Nrf2 為帽領堿性亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族成員，由高度保守的結構域Neh1~7 組成，受Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Keap1）負向調控，是調節細胞氧化應激反應的重要因子，參與抗炎、抗氧化、凋亡等過程。機體處于生理狀態時，Nrf2 經Neh2 與Keap1 結合在胞質中。在各種應激情況下，Keap1 末端的半胱氨酸殘基發生氧化還原反應被修飾，因此構象改變。從胞質中Keap1 上脫離的Nrf2，經磷酸化和易位入核，在核內同Maf 蛋白和Jun bZip 轉錄因子形成異源二聚體，再以Neh4、Neh5 與抗氧化反應元件精準結合。隨后在環腺苷酸效應元件結合蛋白、轉錄激活因子等作用下，Nrf2介導的轉錄過程得以啟動，正向調控下游靶基因，啟動抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶等活性調節［7，17，20］。HO-1，又稱熱休克蛋白32，是Nrf2調控的下游酶物質，普遍存在于哺乳動物體內血細胞代謝旺盛的骨髓、肝、脾等臟器中。在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、細胞色素P450 的參與下［7］，HO-1 將血紅素降解為膽綠素、一氧化碳和亞鐵離子，進而產生抗氧化、抗炎、抗凋亡等積極作用［17，21］。于是，我們作出假設，AVT 對ALI 小鼠的保護效應也可能與此條信號通路有關。為了驗證這種假設，本研究以AVT 作為干預藥物，發現給予了AVT 灌胃的ALI小鼠Nrf2 和HO-1 蛋白表達均上調，肺組織損傷和呼吸功能也有所改善，表明AVT 可通過激活Nrf2/HO-1通路發揮抗炎效應。文獻［18］報道，從珍貴的傳統中草藥冬蟲夏草中提取的嘌呤類生物堿冬蟲夏草素能夠誘導Nrf2 從細胞質轉位到細胞核并激活，以此上調ALI大鼠肺組織中HO-1的表達和酶活性，從而緩解肺組織損傷。據此，我們推測，本研究中AVT 對Nrf2/HO-1 通路的激活作用也可能與促進Nrf2 轉位入核致Nrf2 轉錄增加有關，但仍需進一步的實驗研究證明。

綜上所述，AVT 可減輕LPS 誘導ALI 小鼠的炎癥反應，這可能與激活Nrf2/HO-1通路有關。