基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討甘草治療異位性皮炎的作用機(jī)制

楊素青，沈成英，周莉華，李靖陽，申寶德，胡建新

作者單位：1江西省人民醫(yī)院（南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院）藥學(xué)部，江西 南昌 330006；

2南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330036；

3江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004

異位性皮炎（atopic dermatitis， AD），又稱特應(yīng)性皮炎或異位性濕疹，是臨床上常見的一種皮膚屏障破壞、免疫功能失調(diào)的慢性炎癥性皮膚病［1］。已有研究［2］表明，全球AD病人數(shù)高達(dá)2.3億，兒童發(fā)病率為15%~25%，成人患病率約為1%~10%。AD 病因復(fù)雜，反復(fù)發(fā)作，難以治愈，且常引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前，臨床治療AD 的常用藥物糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥物及免疫抑制劑等長期使用副作用大，病人依從性差［3］。近年來，傳統(tǒng)中藥在治療慢性復(fù)雜疾病過程中發(fā)揮了舉足輕重的作用，具有治療效果理想及毒副作用較低等優(yōu)勢(shì)。其中，甘草因具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、皮質(zhì)激素樣等作用，在皮膚科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［4］。甘草及其活性成分制劑作為經(jīng)驗(yàn)用藥在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療AD，且效果顯著［5-6］。然而，甘草治療AD 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制等尚不明確。

鑒于中藥治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特性，基于實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)其進(jìn)行靶點(diǎn)鑒定和分子機(jī)制分析成本往往較為昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且對(duì)儀器設(shè)備等實(shí)驗(yàn)條件要求較高［7-8］。如果中藥的潛在靶點(diǎn)蛋白不能被鎖定在較小空間范圍內(nèi)，則需要重復(fù)進(jìn)行大量的高難度實(shí)驗(yàn)篩選工作。隨著計(jì)算機(jī)和公共的化學(xué)基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫的發(fā)展，中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)逐漸興起，它可以利用各種靶點(diǎn)預(yù)測(cè)方法找出與中藥成分作用概率大的一系列蛋白質(zhì)，加速整個(gè)中藥作用機(jī)制的闡述過程［9-11］。然而，現(xiàn)有的中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究模式存在一些不足。例如，收集中藥化學(xué)成分的來源過于單一或毫無文獻(xiàn)驗(yàn)證及成分過濾信息，導(dǎo)致收集的成分信息不可靠或篩選出的藥理活性成分對(duì)抗該疾病無選擇性等；靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的方法單一（例如廣泛應(yīng)用的TCMSP［12］，Swis?sTargetPrediction［13］），由于每種方法的算法以及描述的分子維度不同，單用一種方法極易導(dǎo)致較大的預(yù)測(cè)偏差。因此，本研究自2021 年9 月至2022 年4 月通過泛干擾化合物過濾、物理性質(zhì)過濾、ADME 評(píng)估、毒性評(píng)估等獲得高質(zhì)量高可信度的甘草潛在活性成分，利用多平臺(tái)、多尺度的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具，借助中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)甘草治療AD的主要活性成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，初步解析其治療AD的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1.1 泛干擾化合物過濾PAINS：意指泛干擾化合物，即高通量篩選中呈現(xiàn)陽性結(jié)果的頻繁命中化合物（frequent hitter， FH），該類化合物對(duì)多數(shù)靶點(diǎn)具有相互作用［14］。使用python 包Scopy 對(duì)成分進(jìn)行過濾。

1.1.2 成藥性過濾（1）Lipinski 五規(guī)則與Pfizer 規(guī)則：Lipinski 五規(guī)則和Pfizer 規(guī)則可作為類藥性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。Lipinski 五規(guī)則包括分子量<500；氫鍵給體數(shù)目<5；氫鍵受體數(shù)目<10；脂水分配系數(shù)<5；旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量≤10。Pfizer 規(guī)則包括log P>3；極性表面積（topological polar surface area，TPSA）<75。去除不符合Pfizer 規(guī)則并且違反Lipinski 五規(guī)則中三項(xiàng)規(guī)則的成分。

（2）ADME 評(píng)估：采用薛定諤Shordinger 軟件的QikProp 模塊計(jì)算上述過濾后成分的吸收、分布、代謝、排泄（absorption， distribution，metabolism，excre?tion，ADME）性質(zhì)，包括脂溶性QPlogo/w（Octanol/Water Partition Coefficient），水溶性QPlogS（aqueous solubility），細(xì)胞滲透率QPPcaco（Apparent Caco-2 Cell Permeability in nm/sec），人類口服吸收率（per?cent human oral absorption，HOA）。按照建議的QPlogo/w-2.0~6.5，QPlogS-6.5~0.5，QPPcaco>500，HOA>80% 原則進(jìn)行過濾，去除違反ADME 性質(zhì)>3條的成分。

1.1.3 毒性過濾將上述原則過濾后的成分使用ADMET Lab 2.0（https：//admetmesh.scbdd.com/）中的毒性模塊進(jìn)行預(yù)測(cè)［15］，包括hERG 毒性，肝毒性（the human hepatotoxicity，H-HT），藥源性肝損傷（druginduced liver injury，DILI），致畸性（AMES toxicity），大鼠口服急性毒性（rat oral acute toxicity，ROA），移除符合毒性規(guī)則>2的成分。

1.1.4 基于經(jīng)驗(yàn)的過濾手動(dòng)檢查刪除長鏈烷烴/不飽和脂肪酸等經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為無活性意義的成分。

1.2 甘草活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過4 種常用的基于配體的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)平臺(tái)SEA （http：//sea.bkslab.org/search/），SwissTargetPrediction （http：//www.swisstar?getprediction.ch/） ，Poly pharmacology Browser PPB2（http：//ppb2.gdb.tools/）和TargetNet （http：//targetnet.scbdd.com/）， 對(duì)篩選得到的甘草活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，以獲取甘草發(fā)揮抗AD可能的作用途徑。

瓷貼面修復(fù)，因其色澤穩(wěn)定、對(duì)牙齦無刺激、牙體預(yù)備量少等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于臨床中[1]。傳統(tǒng)的修復(fù)方法，主要依靠肉眼觀察及手工來完成，存在一定的誤差，既增加了患者的每次就診的時(shí)間和就診次數(shù)，又降低了患者的舒適程度。隨著科技的發(fā)展及口腔技術(shù)的改革創(chuàng)新，數(shù)字化技術(shù)在口腔領(lǐng)域中逐漸被廣泛應(yīng)用，目前口腔醫(yī)生已可采用數(shù)字化技術(shù)制作出更精確的全瓷貼面修復(fù)體[2]，在時(shí)間效率、制作精度和患者舒適度方面顯示出了更多的優(yōu)勢(shì)。本研究對(duì)數(shù)字化方法和傳統(tǒng)方法制作的全瓷貼面的臨床療效進(jìn)行了觀察。

由于不同的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)平臺(tái)展示預(yù)測(cè)結(jié)果的靶點(diǎn)注釋ID 各不相同，如SEA 采用Entry name，PPB2采用ChEMBL ID，SwissTargetPrediction 和TargetNet采用UniProt ID（ 如Tankyrase-1，Entry name：TNKS1_HUMAN，ChEMBL ID： CHEMBL6164，Uni?Prot ID： O95271）。因此，我們通過Python 包進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)爬取與ID 轉(zhuǎn)換獲取所有預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的注釋信息，注釋信息包含ChEMBL ID、UniProt ID、Entry name，基因名稱。其中基因名稱為標(biāo)準(zhǔn)注釋信息。

1.3 AD 潛在靶點(diǎn)收集通過OMIM（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）和GeneCards 5.0（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以“Atopic Dermatitis”為關(guān)鍵詞，檢索AD 相關(guān)的治療靶點(diǎn)。通過合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫收錄的靶點(diǎn)，再據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研與經(jīng)驗(yàn)判斷進(jìn)一步篩選得到AD潛在靶點(diǎn)基因。

1.4 “中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Python代碼將活性成分在每個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)都轉(zhuǎn)換為基因名稱，然后對(duì)四個(gè)網(wǎng)站的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行合并得到該成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。將甘草所有活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與AD 潛在靶點(diǎn)取交集靶點(diǎn)，即得到甘草成分抗AD潛在靶點(diǎn)。將獲取的活性成分-蛋白靶點(diǎn)的相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 軟件構(gòu)建可視化的“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 生物通路富集分析及“中藥-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為說明預(yù)測(cè)出的抗AD 靶點(diǎn)在基因功能中的作用，采用DAVID V6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）功能注釋和富集分析。GO 功能富集分析是為了進(jìn)一步分析甘草活性成分的抗AD 潛在靶點(diǎn)蛋白在基因功能中擬發(fā)揮的作用。將研究物種限定為人類（homo sapiens），選擇生物過程（biological process， BP）、細(xì)胞組成（cellular compo?nent， CC）和分子功能（molecular function， MF）三個(gè)部分來進(jìn)行分析，以P<0.05 為篩選條件，對(duì)富集結(jié)果按照P值由小到大排序；KEGG 通路富集分析是分析甘草活性成分的靶點(diǎn)蛋白是通過何種通路發(fā)揮抗AD 的作用。對(duì)KEGG 分析得到的前30 條主要靶點(diǎn)和潛在信號(hào)通路繪制氣泡圖。最后通過Cyto?scape 3.9.0 軟件構(gòu)建與AD 密切相關(guān)的前30 個(gè)“中藥-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將“1.4”項(xiàng)下篩選得到的甘草治療AD 的潛在靶點(diǎn)信息導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），限定物種為“Homo sapiens”，以置信度>0.4 為篩選條件，獲得靶點(diǎn)間的蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）數(shù)據(jù)，再將此數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.7 “中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選通過整合“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、“中藥-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)和PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合每個(gè)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度靠前的靶點(diǎn)蛋白，篩選出甘草抗AD的核心靶點(diǎn)。

1.8 活性成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接從RCSB Pro?tein Data Bank 數(shù)據(jù)庫獲取核心靶點(diǎn)的蛋白三維結(jié)構(gòu)，選取各個(gè)蛋白三維結(jié)構(gòu)的PDB ID，選取蛋白的標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）蛋白-配體復(fù)合物中的配體結(jié)構(gòu)與本文中的核心成分結(jié)構(gòu)大小相近；（2）X線衍射的分辨率 ≤ 2.5 ?，并對(duì)蛋白進(jìn)行包括質(zhì)子化、用缺失的原子補(bǔ)全殘基、并選擇替代位置等處理；然后使用MOE軟件wash模塊對(duì)每個(gè)活性成分進(jìn)行預(yù)處理，包括去除金屬離子、去質(zhì)子化、加氫等；再采用MOE軟件對(duì)接，每個(gè)化合物生成30 個(gè)構(gòu)象，并應(yīng)用基于力場(chǎng)的積分函數(shù)GBVI/WSA dG 對(duì)結(jié)合姿勢(shì)的自由能進(jìn)行打分，所有其他參數(shù)都保持默認(rèn)值；最后，取打分值最高的構(gòu)象重新對(duì)接到相應(yīng)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)中，使用MOE 軟件對(duì)結(jié)合姿勢(shì)、結(jié)合構(gòu)象和相互作用模式進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 甘草活性成分通過文獻(xiàn)報(bào)道及TCMSID數(shù)據(jù)庫，共收集到甘草已知成分212 種。依次通過泛干擾化合物過濾（剩余174個(gè)成分）、成藥性過濾（剩余73 個(gè)成分）、毒性過濾（剩余49 個(gè)成分）以及經(jīng)驗(yàn)過濾，最終獲得甘草的46個(gè)活性成分。

2.2 甘草活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過SEA、SwissTar?getPrediction、PPB2 和TargetNet 軟件對(duì)甘草篩選獲得的46 個(gè)化合物進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。首先，保留這46個(gè)成分在每個(gè)預(yù)測(cè)平臺(tái)的前10個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)（每個(gè)方法各獲得預(yù)測(cè)靶點(diǎn)460個(gè)）。其次，為了進(jìn)一步縮小靶點(diǎn)空間以及獲得更可信的靶點(diǎn)，采用更嚴(yán)苛的靶點(diǎn)過濾規(guī)則進(jìn)行挑選，即靶點(diǎn)被多個(gè)預(yù)測(cè)軟件同時(shí)預(yù)測(cè)或預(yù)測(cè)得分較高才被認(rèn)為是成分的潛在靶點(diǎn)，經(jīng)過篩選共得到甘草46 個(gè)活性成分的149 個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

2.3 AD 潛在靶點(diǎn)通過OMIM 和GeneCards5.0 數(shù)據(jù)庫，以“Atopic Dermatitis”為關(guān)鍵詞，檢索AD 相關(guān)的治療靶點(diǎn)。其中，GeneCards 5.0 以相關(guān)性數(shù)值（Relevance score≥中位數(shù)）作為篩選條件。通過合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫收錄的靶點(diǎn)，再據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研與經(jīng)驗(yàn)判斷進(jìn)一步篩選得到AD潛在靶點(diǎn)基因404個(gè)。

2.4 甘草的“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將46個(gè)化合物預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)與AD 潛在靶點(diǎn)取交集靶點(diǎn)，即得到甘草的AD 潛在靶點(diǎn)共47 個(gè)。甘草中共29個(gè)成分與這些蛋白具有相互作用（另外17個(gè)成分并未預(yù)測(cè)到AD相關(guān)靶點(diǎn)），涉及的成分-蛋白相互作用關(guān)系對(duì)共157對(duì)。潛在活性成分的物理化學(xué)性質(zhì)見表1。使用預(yù)測(cè)到的相互作用數(shù)據(jù)，借助Cyto?scape 3.9.0軟件構(gòu)建的“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。圖中方形為甘草的29 個(gè)活性成分，圓形為這些成分潛在的作用靶點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)的大小代表其在網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)度，即方形的大小代表成分被靶點(diǎn)命中的個(gè)數(shù)多少，圓形的大小代表靶點(diǎn)被成分命中的個(gè)數(shù)多少。

表1 篩選出的甘草活性成分的理化性質(zhì)

由圖1可推知甘草中的化學(xué)成分通過調(diào)節(jié)多個(gè)蛋白來發(fā)揮藥理活性作用。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度排名靠前的成分依次為甘草查爾酮C（MOL11，節(jié)點(diǎn)度值為13）、甘草查爾酮A（MOL10，節(jié)點(diǎn)度值為12）、異甘草黃酮醇（MOL6，節(jié)點(diǎn)度值為12）、光甘草定（MOL3，節(jié)點(diǎn)度值為11）、光甘草寧（MOL28，節(jié)點(diǎn)度值為10）、甘草黃酮醇（MOL13，節(jié)點(diǎn)度值為9）、甘草黃酮C（MOL25，節(jié)點(diǎn)度值為8）、異芒柄花素（MOL5，節(jié)點(diǎn)度值為8）、異甘草素（MOL7，節(jié)點(diǎn)度值為8）、芒柄花素（MOL1，節(jié)點(diǎn)度值為8）、山柰酚（MOL9，節(jié)點(diǎn)度值為6）、異甘草苷（MOL8，節(jié)點(diǎn)度值為5）、甘草酸（MOL4，節(jié)點(diǎn)度值為5）、芒柄花苷（MOL23，節(jié)點(diǎn)度值5）；被成分命中較多的靶點(diǎn)依次是ALOX5（Ara?chidonate 5-Lipoxygenase，節(jié)點(diǎn)度值為12）、EGFR（epidermal growth factor receptor，節(jié)點(diǎn)度值為10）、PPARG （peroxisome proliferator-activated receptor gamma，節(jié)點(diǎn)度值為9）、MIF（macrophage migration inhibitory factor，節(jié)點(diǎn)度值為9）、PTGS2（prostaglan?din-endoperoxide synthase 2，節(jié)點(diǎn)度值為9）、TLR9（toll like receptor 9，節(jié)點(diǎn)度值為9）、AHR（aryl hydro?carbon receptor，節(jié)點(diǎn)度值為9）、IL-2（Interleukin-2，節(jié)點(diǎn)度值為8）。

2.5 生物通路富集分析及“中藥-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建我們利用DAVID V6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)上述47 個(gè)潛在抗AD 靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG通路富集分析。GO富集分析后共獲得291個(gè)條目，其中，BP 結(jié)果包含217 個(gè)條目，主要涉及炎癥反應(yīng)、基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié)、凋亡過程負(fù)調(diào)控、MAP激酶活性的正向調(diào)節(jié)以及肽基絲氨酸磷酸化的正向調(diào)控等多種細(xì)胞凋亡反應(yīng)；CC 結(jié)果包含29 個(gè)條目，主要涉及細(xì)胞外空間、膜筏、細(xì)胞表面、胞外區(qū)、質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)以及細(xì)胞核的構(gòu)成；MF 結(jié)果包含45 個(gè)條目，主要涉及相同的蛋白結(jié)合、受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白酪氨酸激酶、蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶活性以趨化因子受體活性等。選取GO 富集分析中每個(gè)類別的排名靠前項(xiàng)繪制柱狀圖，見圖2A。

圖2 預(yù)測(cè)蛋白的富集分析結(jié)果：A為GO生物學(xué)功能；B為KEGG通路

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，設(shè)定生物信號(hào)通路P<0.05，共獲得75條信號(hào)通路。將所獲得通路以?logP值轉(zhuǎn)換的P值排序，選取富集程度前30 條繪制高級(jí)氣泡圖，見圖2B。分析KEGG 結(jié)果可知，甘草參與抗AD 主要有缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）、腫瘤壞死因子（TNF）、核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路等。

通過KEGG 數(shù)據(jù)構(gòu)建的甘草“中藥-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖見圖3，其中節(jié)點(diǎn)度排名靠前的10 個(gè)基因是PIK3CA（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-ki?nase catalytic subunit alpha，節(jié)點(diǎn)度值為55）、AKT1（AKT serine/threonine kinase 1，節(jié)點(diǎn)度 值為55）、RELA（Nuclear factor NF-kappa-B p65 subunit，節(jié)點(diǎn)度值為44）、TNF（tumor necrosis factor，節(jié)點(diǎn)度值為38）、BRAF（serine/threonine-protein kinase B-raf，節(jié)點(diǎn)度值為27）、EGFR（epidermal growth factor recep?tor，節(jié)點(diǎn)度值為22）、CASP3（caspase 3，節(jié)點(diǎn)度值為24）、MTOR（mechanistic target of rapamycin kinase，節(jié)點(diǎn)度值為21）、STAT3（signal transducer and activa?tor of transcription 3，節(jié)點(diǎn)度值為19）。

圖3 甘草“中藥-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析通過String 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.9.0軟件針對(duì)所獲得的潛在靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。甘草潛在靶點(diǎn)間相互作用的平均節(jié)點(diǎn)度值為15.4，其中大于平均度值靶點(diǎn)共22 個(gè)。PPI 網(wǎng)絡(luò)包含47 個(gè)節(jié)點(diǎn)和362 條邊。PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示，TNF（Tumor Necro?sis Factor，節(jié)點(diǎn)度值為38）、AKT1（AKT Serine/Threo?nine Kinase 1，節(jié)點(diǎn)度值為36）、IL-2（Interleukin-1，節(jié)點(diǎn)度值為32）、VEGFA（vascular endothelial growth factor receptor，節(jié)點(diǎn)度值為32）、STAT3（signal trans?ducer and activator of transcription 3，節(jié)點(diǎn)度值為30）、EGFR（epidermal growth factor receptor，節(jié)點(diǎn)度值為29）、PTGS2（prostaglandin-endoperoxide syn?thase 2，節(jié)點(diǎn)度值為28）、CXCL12（C-X-C Motif Che?mokine Ligand 12，節(jié)點(diǎn)度值為26）、CASP3（Caspase 3，節(jié)點(diǎn)度值為24）、MTOR（mechanistic target of rapa?mycin kinase，節(jié)點(diǎn)度值為20）等靶點(diǎn)為PPI 網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)度值較高。

2.7 “中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選通過整合“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、“中藥-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)和PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合每個(gè)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度靠前的靶點(diǎn)蛋白，篩選出甘草抗AD 的核心靶點(diǎn)用于后續(xù)的分子對(duì)接。其中，“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)獲得核心靶點(diǎn)9個(gè)、“中藥-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)獲得10 個(gè)核心靶點(diǎn)、PPI網(wǎng)絡(luò)獲得核心靶點(diǎn)22個(gè)。通過靶點(diǎn)去重，共獲得核心靶點(diǎn)24個(gè)。

2.8 活性成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接對(duì)篩選得到的29 個(gè)有效成分和22 個(gè)核心靶點(diǎn)（核心靶點(diǎn)中，除TLR9 與STAT6 外，TLR9 無人類相關(guān)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，STAT6 蛋白無口袋對(duì)接）進(jìn)行分子對(duì)接，核心蛋白基本信息見表2。為了從分子水平闡明蛋白和化合物的作用模式，將化合物對(duì)接至蛋白的活性口袋，29 個(gè)分子與這22 個(gè)核心蛋白的平均親和力S 值為（?6.61±0.79）kJ/mol，證明這些成分與蛋白之間具有比較強(qiáng)的結(jié)合親和力［16］。

表2 分子對(duì)接蛋白信息

此外，我們繪制結(jié)合親和力強(qiáng)的成分-蛋白對(duì)接示意圖和相互作用模式圖進(jìn)行分析，包括光甘草定-EGFR，光甘草定-IL-2，甘草酸-EGFR，甘草酸-IL-2，甘草酸-PTGS2，甘草酸-TNF，異甘草素-IL-2，異甘草素-AKT1，這些成分與蛋白之間均形成了數(shù)目不等的氫鍵。

光甘草定結(jié)合到EGFR 蛋白活性位點(diǎn)，與活性對(duì)接口袋的氨基酸殘基Leu 718 形成氫鍵相互作用，另外與氨基酸殘基Pro 794 形成PI-cation 相互作用。光甘草定結(jié)合到IL-2 蛋白活性位點(diǎn)，與活性對(duì)接口袋的氨基酸殘基Thr 41 形成氫鍵相互作用，另外與氨基酸殘基Leu 72形成PI-cation相互作用。甘草酸結(jié)合到EGFR 蛋白活性位點(diǎn)，與活性對(duì)接口袋的氨基酸殘基His 805、Lys 745、Met 790 形成3 個(gè)氫鍵相互作用。甘草酸結(jié)合到IL-2 蛋白活性位點(diǎn)，與活性對(duì)接口袋的氨基酸殘基Arg 38、Glu 62 形成兩個(gè)氫鍵相互作用，另外與氨基酸殘基Leu 72、Phe 42形成PI-cation相互作用。甘草酸結(jié)合到PTGS2蛋白活性位點(diǎn)，與活性對(duì)接口袋的氨基酸殘基His207、Asn 382、Tyr 385 形成4 個(gè)氫鍵相互作用，另外與氨基酸殘基Leu 72、Phe 42 形成PI-cation 相互作用。甘草酸結(jié)合到TNF 蛋白活性位點(diǎn)，與活性對(duì)接口袋的氨基酸殘基Tyr 195、Tyr 135形成PI-cation 相互作用。異甘草酸結(jié)合到AKT1 蛋白活性位點(diǎn)，與活性對(duì)接口袋的氨基酸殘基Glu 228形成氫鍵相互作用，另外與氨基酸殘基Met 281形成PI-cation相互作用。異甘草酸結(jié)合到IL-2 蛋白活性位點(diǎn)，與活性對(duì)接口袋的氨基酸殘基Arg 38 形成氫鍵相互作用，另外與兩個(gè)氨基酸殘基Leu 71、Phe 42 形成PI-cation 相互作用。

3 討論

本研究針對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)現(xiàn)有方法在收集中藥化學(xué)成分的來源、成分過濾方法以及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)方法單一的不足，提出了利用泛干擾化合物過濾、物理性質(zhì)過濾、ADME評(píng)估、毒性評(píng)估等方法收集高質(zhì)量高可信度的中藥活性成分，并結(jié)合多平臺(tái)多尺度的分子靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具，充分利用每種方法的優(yōu)勢(shì)提高預(yù)測(cè)能力，以得到更加客觀公正有效的甘草抗AD活性成分及其作用機(jī)制。

我們的研究結(jié)果顯示，甘草抗AD 的潛在活性成分共29 個(gè)，靶向47 個(gè)潛在的AD 靶點(diǎn)。“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值靠前成分主要有甘草查爾酮C、甘草查爾酮A、異甘草黃酮醇、光甘草定、光甘草寧、甘草黃酮醇、甘草黃酮C、異芒柄花素、異甘草素、芒柄花素、山柰酚、異甘草苷、甘草酸等。現(xiàn)有研究表明，甘草酸可通過抑制HMGB1-RAGE 表達(dá)，進(jìn)而抑制PI3K/AKT/NF-κB 和ERK/NF-κB 信號(hào)通路的表達(dá)，減少TNF-α、IL-6 等炎性因子的釋放以減輕DNCB 誘導(dǎo)的小鼠AD 皮損樣癥狀［17］。異甘草素可通過抑制DNCB 誘導(dǎo)AD 模型小鼠血液中IgE 和Th2細(xì)胞因子上調(diào)，抑制皮損部位的促炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6 以及IL-4 的表達(dá)，發(fā)揮治療AD 作用［18］。甘草查爾酮C 具有抗炎作用，可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/eNOS和NF-κB/iNOS/NO 信號(hào)通路、降低炎性因子的釋放，以減輕AD臨床癥狀［19］。此外，甘草查爾酮A、光甘草定等均具有較好的抗炎作用［20］，這說明甘草抗AD 可能是通過多種成分進(jìn)行共同調(diào)控。此外，異甘草黃酮醇、光甘草寧、甘草黃酮醇、甘草黃酮C、異芒柄花素、異甘草苷等成分對(duì)AD 的治療作用尚未得到證實(shí)，這為甘草治療AD 的作用機(jī)制給出了新的潛在化合物。

通過對(duì)47 個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG 通路富集分析，“中藥-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示甘草獲得的這47 個(gè)潛在靶點(diǎn)靶向AD 的通路主要涉及HIF-1、TNF、NF-κB 等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路均與炎癥免疫應(yīng)答密切相關(guān)。AD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、免疫紊亂、皮膚屏障受損等。HIF-1 是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，是應(yīng)答缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵因子，在生物發(fā)育、代謝、貧血、損傷修復(fù)等生理和病理過程中具有重要生物學(xué)意義［21］，HIF-1α 表達(dá)的升高會(huì)破壞AD 皮膚的緊密連接，加重AD 皮損狀態(tài)［22］。TNF 信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)人體炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與免疫應(yīng)答，常常與NFκB信號(hào)通路構(gòu)成TNF/NF-κB通路發(fā)揮上述作用［23］。NF-κB信號(hào)通路具有抗凋亡作用，可被炎癥、自身免疫性疾病感染或者癌癥激活［24］，當(dāng)AD 發(fā)生時(shí)，細(xì)胞因子與附近的血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合，激活NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)大量炎性因子的表達(dá)和釋放［25］；Sung 等［26］研究證明阻斷NF-κB 信號(hào)通路可以改善AD 癥狀。總之，AD 的發(fā)病與上述通路密切相關(guān)，且本研究的富集分析結(jié)果也表明甘草活性成分的作用靶點(diǎn)與上述通路相關(guān)。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得到靶點(diǎn)-靶點(diǎn)間的相互作用，了解了蛋白與蛋白之間在參與生物信號(hào)傳遞、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、能量和物質(zhì)代謝及細(xì)胞周期調(diào)控等生命過程的各個(gè)環(huán)節(jié)的相互作用關(guān)系。通過整合“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、“中藥-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)，得到“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)獲得甘草對(duì)抗AD 的24 個(gè)核心靶點(diǎn)，主要有TNF、AKT1、IL-2、VEGFA、STAT3、EGFR、PTGS2、CX?CL12、CASP3、MTOR 等。將29 個(gè)潛在的活性成分與潛在靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接親和力結(jié)果顯示，這些活性成分和潛在靶點(diǎn)之間的結(jié)合構(gòu)型具有強(qiáng)烈的親和活性和良好的相互作用模式。其中，甘草的主要活性成分如甘草酸與TNF、EGFR、PTGS2、IL-2 形成了數(shù)量不等的氫鍵，獲得了較好的對(duì)接模式與較高親和力；異甘草素與AKT1、IL-2 蛋白形成較好的對(duì)接模式與較高親和力。光甘草定與EGFR、IL-2蛋白形成較好的對(duì)接模式與較高親和力。有研究證實(shí)，TNF 可通過刺激免疫細(xì)胞分泌各種炎性因子從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生；Liu 等［27］研究發(fā)現(xiàn)TNF超家族的TWEAK 可通過誘導(dǎo)Fn14 參與AD 炎癥反應(yīng)和角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡；AKT1 表達(dá)的降低能夠引起角質(zhì)形成細(xì)胞微絲聚集蛋白加工減少，使AD 皮膚屏障功能受損［28］；AD 發(fā)生時(shí)，其他細(xì)胞因子會(huì)誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)，加重AD 病情，如Chen 等［29］研究發(fā)現(xiàn)IL-6和 IFN-γ 能夠誘導(dǎo)VEGF-A 表達(dá)升高，促進(jìn)IL-4轉(zhuǎn)基因AD 模型小鼠的皮膚微血管生成，進(jìn)而加重AD癥狀；STAT3參與炎癥、免疫、凋亡及細(xì)胞增殖等過程，可通過調(diào)節(jié)Th2 細(xì)胞分化、炎性因子分泌、刺激各種趨化因子等進(jìn)而影響AD 病程［30］；此外，IL-2［31］、PTGS2［32］、CXCL12［33］等均在AD 中檢測(cè)到高表達(dá)，被證實(shí)是AD的重要靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究以臨床常用藥物—甘草為探討對(duì)象，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接分析，初步論證了甘草治療AD 是通過甘草酸、甘草查爾酮C、甘草查爾酮A、異甘草素、光甘草定等活性成分作用于TNF、AKT1、IL-2、VEGFA、STAT3、EGFR、PTGS2 等多種基因靶點(diǎn)，從而影響HIF-1 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等多種通路發(fā)揮作用，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。甘草抗AD 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及臨床上與甘草多配伍其他藥物的協(xié)同作用研究將是課題組接下來探索的出發(fā)點(diǎn)和拓展點(diǎn)。