基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質譜聯用技術的益心舒膠囊化學成分分析與鑒定

張歡，尹德錄，路翔宇，蘇炳新

作者單位：連云港市第一人民醫院心血管內科，江蘇 連云港 222000

益心舒膠囊由人參、麥冬、五味子、黃芪、丹參、川芎、山楂7 味中藥組成，其中人參細粉入藥，五味子、丹參85%乙醇提取入藥，麥冬等4 味水煎煮入藥；具有益氣復脈，活血化瘀，養陰生津的功效，主要用于氣陰兩虛，瘀血阻脈所致的胸痹，癥見胸痛胸悶、心悸氣短、脈結代；冠心病心絞痛見上述證候者［1］。臨床研究表明，益心舒膠囊單獨用藥或聯合用藥對持續性心房顫動、心力衰竭、心絞痛等癥均有效［2-5］。益心舒膠囊現收錄于2020 年版《中國藥典》（一部），作為非處方藥品，在心血管疾病中應用廣泛。但是其相關物質基礎研究薄弱，藥物組成復雜，藥效成分不清，進而影響了其有效的質量控制和更加廣泛的臨床應用。

本研究自2021 年9―12 月采用UPLC-Q-TOFMS 技術對益心舒膠囊的化學成分進行系統分析與鑒定，為其藥效物質基礎研究和臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑益心舒膠囊（貴州信邦制藥股份有限公司，批號20210109）；人參皂苷Rg1（批號4318，純度98.0%）、人參皂苷Rb1（批號2326，純度98.0%）、人參皂苷Rd（批號3505，純度98.0%）、丹參素鈉（批號6716，純度98.0%）、丹酚酸B（批號5853，純度98.0%）、迷迭香酸（批號2886，純度98.0%）均購自上海詩丹德生物技術有限公司；丹酚酸 A（批號O-011-170607，純度98.0%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；人參皂苷Ro（批號20120805，純度98.0%）購自上海源葉生物科技有限公司；人參皂苷Re（批號110754-200320，純度96.0%）購自中國食品藥品檢定研究院。

乙腈和甲醇（色譜級，Thermo Fisher Scientific 公司）、甲酸（色譜級，阿拉丁試劑優有限公司），超純水由純水儀制備（Milli-Q Integral，Millipore，Bedford，USA）。

1.2 儀器Waters ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀（Waters，USA），Waters Synapt G2-Si Q-TOF 質譜儀（Waters，USA）；超聲波水浴（德國Elma P180H）；電子天平（Quintix 224-1 CN-1，賽多利斯北京有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件色譜柱Waters Acquity HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0~13 min，5%~70% B；13~15 min，70%~95% B；15~17 min，95% B）；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2.0 μL。

1.3.2 質譜條件電噴霧離子源（ESI），正離子和負離子模式檢測；采集方法：Fast DDA；掃描范圍：m/z50~1 500；采集前三強母離子的二級碎片；毛細管噴霧電壓離子：2.0 kV；錐孔電壓：40 V；源溫度：100 ℃；去溶劑氣溫度：450 ℃；去溶劑氣流速：800 L/h，錐孔氣流速：50 L/h；負離子碰撞能：低質量端能量設置為20~30 V，高質量端能量設置為60~100 V；正離子碰撞能：低質量端能量設置為10~30 V，高質量端能量設置為40~60 V。

1.3.3 溶液制備

1.3.3.1 供試品溶液精密稱取益心舒膠囊粉末20 mg，置于離心管中，加入50%甲醇水溶液1 mL，超聲（功率1 130 W，頻率37 kHz）提取30 min，冷卻至室溫后，離心（14 000 r/min，10 min），取上清，即得。

1.3.3.2 對照品溶液分別精密稱定對照品人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd、Ro、丹參素鈉、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸各1 mg，分別置于離心管中，加入1 mL 50%甲醇使其溶解，各移取10 μL，再用50%甲醇稀釋，將其制成質量濃度為10 mg/L的混標溶液。

1.4 數據分析通過文獻檢索，歸納總結分離自人參、麥冬、五味子、黃芪、丹參、川芎、山楂等7個益心舒膠囊組成藥味的化學成分信息，建立化合物庫。數據庫中包括各化合物名稱、結構、分子式、分子量等信息，數據庫采用Progenesis SDF（Waters，USA）進行管理。采用Waters MassLynx V4.1 分析供試品溶液中化合物的保留時間、一級質譜、二級質譜等信息，一級質譜中限定質量偏差（<5 mDa），根據一級質譜推導化合物分子式，分子式輸入Progenesis SDF檢索自建數據庫，并與對照品、文獻報道數據進行比對，對化合物進行結構鑒定。

2 結果

在上述實驗條件下采集益心舒膠囊的UPLCQTOF 基峰離子流圖，見圖1。按照“1.3”項下方法，共解析出86 個化合物，見表1。其中9 種化合物經過與對照品比對保留時間及一級、二級質譜圖進行鑒定，其余化合物結合數據庫及參考文獻進行鑒定。

圖1 益心舒膠囊正、負離子模式下基峰離子流圖：A為負離子模式；B為正離子模式

表1 益心舒膠成分鑒定結果

2.1 皂苷類化合物皂苷類成分主要來源于人參，益心舒膠囊中共鑒定了35種皂苷類化合物，包括原人參三醇型（PPT）5 個、原人參二醇型（PPD）12 個、齊墩果酸型（OA）5 個、側鏈雜化型6 個以及酰化型7個。

原人參三醇型與原人參二醇型皂苷負離子模式下，大多形成甲酸加合離子，二級裂解時通常優先丟失糖配基，并獲得苷元離子信息，其中原人參三醇型皂苷苷元離子為m/z475.38，原人參二醇型皂苷苷元離子為m/z459.38。中性丟失162.05 Da，146.06 Da 和132.04 Da 分別對應葡萄糖、鼠李糖和木糖/阿拉伯糖。以人參皂苷Re（化合物11）為例，一級質譜在m/z991.546 9 處得到加合離子［M+FAH］?，推導分子式為C48H82O18。二級碎片信息：m/z945.54 ［M-H］?依次丟失一個葡萄糖（m/z783.49）、一個鼠李糖得到（m/z637.43）、及一個葡萄糖得到苷元離子（m/z475.38），以及苷元離子側鏈斷裂丟失C6H12產生（m/z391.28）。通過與對照品比對，最終確定11號峰為ginsenoside Re，其質譜裂解途徑如圖2 所示。化合物44 保留時間為9.73 min，在負離子模式下可見其甲酸加合離子峰m/z991.548 3 ［M+FA-H］?，二級質譜可以觀察到碎片離子m/z945.54，783.49，621.44，459.38，375.29，分別對應脫氫峰，以及因此丟失三個葡萄糖及苷元離子側鏈斷裂，因此化合物44為帶有三個葡萄糖的原人參二醇型皂苷，通過檢索化合物庫并與文獻［6］對比，化合物44 鑒定為notoginsenoside K。類似地，還鑒定了4 個原人參三醇型皂苷（化合物12，24，32，42）和10個原人參二醇型皂苷（化合物25，26，28，30，34，35，40，51，56，57）。

圖2 ginsenoside Re負離子下的裂解途徑

側鏈雜化型皂苷可以通過二級質譜中苷元離子進行鑒別，如化合物49 和50 的苷元離子均為m/z457.37，相比于原人參二醇型皂苷苷元，其在苷元C-20側鏈上多一個雙鍵，結合化合物的保留順序［7］，化合物49 和50 分別鑒定為ginsenoside Rg6 和ginsen?oside F4。類似地根據文獻報道的保留順序［8］，化合物52 和55 分別鑒定為ginsenoside Rk3 和ginsen?oside Rh4。

酰化皂苷根據酰化基團中是否含有羧基分別中性皂苷（乙酰化）和酸性皂苷（丙二酰化）。乙酰化取代皂苷與原人參二醇型及原人參三醇型相近，一級質譜主要觀察到甲酸加合離子；丙二酰取代皂苷主要形成［M-H］?。以化合物41為例，在一級質譜圖中，主要形成［M-H］?以及源內碎裂形成m/z987.55 ［M-CO2-H］?，在二級碎片中觀察到脫去丙二酰基的m/z945.54 ［M-Mal-H］?，以及相應的脫糖碎片m/z783.48，621.44，459.38，因此化合物41 為含有三個葡萄糖基和一個丙二酰基取代的原人參二醇型皂苷，經過數據庫比對鑒定為malonyl ginsenoside Rd，與文獻報道基本一致［9］，其質譜裂解途徑如圖3所示。

圖3 malonyl ginsenoside Rd負離子下的裂解途徑

齊墩果酸型皂苷可以通過苷元離子m/z455.35進行鑒定，因為齊墩果酸型皂苷大多含有葡萄糖醛酸取代，在一級質譜中通常形成［M-H］?。以人參皂苷Ro（化合物33）為例，一級質譜在m/z955.4893 觀察到準分子離子峰［M-H］-。二級質譜中可以檢測到碎片離子m/z793.44，613.37，569.38，469.38，455.35，由脫糖和二氧化碳等產生，通過與對照品比對，最終確定化合物33 為人參皂苷Ro，其質譜裂解途徑如圖4所示。

圖4 ginsenoside Ro負離子下的裂解途徑

2.2 酚酸類化合物酚酸類成分主要為來源于丹參的丹酚酸類化合物，丹酚酸類化合物根據結構類型可以分為單聚體和多聚體（二聚體、三聚體和四聚體），多聚體由多個單聚體通過酯鍵或者醚鍵聚合。丹參素（化合物1）為單聚體丹酚酸類成分，其［M-H］-準分子離子峰為m/z197.0443，碎裂主要產生丟失水分子和CO2產生m/z135.04，丹參素通過與對照品比對進行鑒定。化合物9 的母離子為m/z359.076 0，分子式推導為C18H16O8，二級碎片中檢測到與丹參素一致的碎片信息（m/z197.04，135.04，123.04），推定為由丹參素組成的二聚體型丹酚酸類化合物，通過數據庫檢索及對照品比對鑒定為迷迭香酸，其質譜裂解途徑如圖5 所示。化合物1 由一級質譜圖可知，其［M-H］?準分子離子峰為m/z717.144 7，在二級質譜中主要檢測到m/z321.04 的碎片及相關離子，其由酯鍵斷裂丟失兩個C9H10O5生成，通過對照品比對，化合物1鑒定為丹酚酸B。

圖5 迷迭香酸負離子下的裂解途徑

2.3 二萜類化合物本品共鑒定二萜類化合物20個，主要為來源于丹參中的二萜醌類化合物及其衍生物。以化合物64為例，正離子模式下擬合分子式為C18H14O3，二級質譜中碎片離子m/z261.09，233.10，205.10，190.08，169.06，141.07，分別對應為［M+H-H2O］+，［M+H-H2O-CO］+，［M+H-H2O-2CO］+，［M+H-CO-C5H6O］+，［M+H-2CO-C5H6O］+，與文獻報道二氫丹參酮Ⅰ碎裂行為基本一致［10］，由此，推測化合物64 為二氫丹參酮Ⅰ，其質譜裂解途徑見圖6。

圖6 二氫丹參酮I正離子下的裂解途徑

2.4 木脂素類化合物本品共鑒定9 個木脂素類化合物，以化合物84 為例，正離子模式下擬合分子式為C23H28O6，二級質譜中碎片離子m/z386.17，370.18，355.15，331.12，316.09，300.10，285.08 分別對應為［M+H-CH3］+，［M+H-OCH3］+，［M+H-CH3-OCH3］+，［M+H-C5H10］+，［M+H-CH3-C5H10］+，［M+HOCH3-C5H10］+，［M+H-OCH3-CH3-C5H10］+，與文獻報道五味子乙素碎裂行為基本一致［11］，由此，推測化合物84為五味子乙素，其質譜理解途徑見圖7。

圖7 五味子乙素正離子下的裂解途徑

2.5 其他除上述化學成分外，本品還檢測到黃酮類如田薊苷、黃芪異黃烷苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3'-甲氧基大豆黃素，及bornyl 7-O-α-Larabinofuranosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside 與積雪草酸。具體結果見表1。

3 討論

中藥復方制劑對一些疑難病癥療效顯著，然而這些中藥制劑成分復雜、作用機制不清，不利于臨床廣泛應用。中藥復方制劑的化學物質基礎研究是有效性、安全性和質量控制的前提［12-13］。液相色譜串聯高分辨質譜具有準確、靈敏、快速等優勢，適用于中藥復方制劑的化學物質基礎研究。本研究將UPLC-QTOF-MS 應用于臨床常用復方益心舒膠囊的化學成分分析，最終確定了86個成分。

檢測到的成分主要為皂苷類、酚酸類、二萜類及木質素類，主要來源于人參、丹參、五味子等三味藥材，可能與益心舒膠囊中各藥味入藥方式有關。粉末入藥的人參及經過乙醇提取五味子、丹參中以次級代謝物為主，而麥冬、黃芪、川芎、山楂等4味藥為水煎煮提取，低極性的次級代謝物含量低難以檢測。2020 年版《中國藥典》（一部）分別以人參皂苷Rg1 和人參皂苷Re、丹酚酸B 為指標對人參和丹參進行質量控制。文獻報道［14］，五味子甲素和五味子乙素是益心舒膠囊治療心力衰竭的關鍵活性成分，他們可以通過減弱內皮素-1 誘導的收縮功能障礙、腦鈉肽含量升高和人誘導多能干細胞衍生心肌細胞形態學變化發揮治療作用。因此，在益心舒膠囊的質量控制中可以進一步考慮對藥味五味子的質量控制。

本研究開展了益心舒膠囊的化學物質基礎研究，值得注意的是，化學成分并不同等于藥效成分。只有吸收入血的成分才可能是發揮藥效的直接物質，因此后期還需要進一步開展益心舒膠囊的藥代及藥動學研究，以及入血成分的活性評價以及分子機制研究，以期更加全面地闡釋益心舒膠囊的作用機制。