一測多評法測定止血化痔合劑中6種黃酮類成分的含量

陳根光，楊麗娜，周承芳，王慶芬

作者單位：聯勤保障部隊第九〇九醫院、廈門大學附屬東南醫院藥劑科，福建 漳州 363000

止血化痔合劑由黃芩、地榆炭、炙黃芪、郁李仁、槐花炭、升麻、甘草、黃柏、赤芍等9 味中藥配制而成，具有清熱燥濕、益氣養血、涼血止血和消腫的功效［1］，對痔瘡的治療有積極的作用，其中黃酮類成分為其主要活性成分［2］。近年來，對中藥處方中主要成分進行定量分析被認為是對中藥進行質量控制的有效方法，但該方法必須提供待測目標物的高純度標準品，而一測多評法（QAMS）只須提供一種標準品就可以同時檢測多種成分的含量，能有效減少分析時間，節省對照品用量，降低檢測成本。由于止血化痔合劑成分復雜、活性成分種類較多，因此，僅靠對單一成分的定量測定無法完全反映中藥復方制劑多成分、多靶點、協同起效等特點，難以實現對該制劑的質量控制，故本實驗自2022 年2―5月采用一測多評法，以黃芩苷為內參物，通過對止血化痔合劑中黃酮類成分進行含量測定，為止血化痔合劑的質量評價提供更全面、多指標的質量控制依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀［二極管陣列檢測器（DAD），美國Agilent 公司］； AUW120D 型電子分析天平（精度：0.01 mg，島津企業管理（中國）有限公司）；水為純化水，磷酸、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純。

對照品蘆丁（批號GZDD-0001，純度≥98%），甘草苷（批號GZDD-0388，純度≥98%），黃芩苷（批號GZDD-0037，純度≥98%），槲皮素（批號GZDD-0002，純度≥98%），黃芩素（批號GZDD-0118，純度≥98%），漢黃芩素（批號GZDD-0714，純度≥98%），均購自貴州迪大生物科技有限責任公司。止血化痔合劑由本院藥劑科制劑室自制。

2 方法與結果

2.1 一測多評方法學考察

2.1.1 色譜條件色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液，梯度洗脫：0～10 min，0%～19%乙腈；10～20 min，19%～23% 乙腈；20～25 min，23%～30% 乙腈；25～30 min，30%～48%乙腈；30～40 min，48%～80%乙腈；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，各成分色譜峰分離度均大于1.5，理論板數均大于5 000。混合對照品、樣品色譜圖見圖1。

2.1.2 混合對照品溶液的制備分別取蘆丁、甘草苷、黃芩苷、槲皮素、黃芩素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為320.3、64.80、155.7、65.55、180.9、5.00 mg/L的混合對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備精密量取相應批號的止血化痔合劑2 mL，置25 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 線性關系考察分別精密吸取混合對照品溶液3、6、8、10、12、15 μL，注入高效液相色譜儀。以對照品進樣質量為橫坐標（X），以對照品的峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得各成分的線性回歸方程，見表1。

表1 混合對照品溶液中6種成分線性關系考察結果

2.1.5 精密度試驗取混合對照品溶液，連續進樣6 針，計算峰面積。含蘆丁、甘草苷、黃芩苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD 分別為1.0%、1.0%、0.8%、1.2%、2.0%、0.9%。

2.1.6 穩定性試驗取止血化痔合劑（批號20211215），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h 進行測定，計算峰面積。含蘆丁、甘草苷、黃芩苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD 分別為2.9%、1.0%、0.4%、1.5%、3.0%、1.5%。

2.1.7 重復性試驗取止血化痔合劑（批號20211215），按“2.1.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，分別進樣分析，記錄6 種成分的色譜峰面積。含蘆丁、甘草苷、黃芩苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD 分別為3.1%、2.7%、0.5%、2.2%、2.9%、1.0%。

2.1.8 加樣回收率試驗精密量取6份已知含量的止血化痔合劑（批號20211215），每份1 mL，置25 mL量瓶中，再分別精密量取并加入對照品溶液適量，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液10μL，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，含蘆丁、甘草苷、黃芩苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素的平均加樣回收率分別為99.07%、96.86%、100.43%、95.72%、96.38%、98.93%，RSD 分別為2.7%、2.8%、2.0%、2.5%、3.2%、2.4%。

2.2 相對校正因子（f）的確定依次精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液3、6、8、10、12、15 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以黃芩苷（s）為內參物，按下列公式分別計算含蘆丁（a）、甘草苷（b）、槲皮素（c）、黃芩素（d）、漢黃芩素（e）的f值。

式中As為內參物對照品s峰面積，Cs為內參物對照品s濃度，Ai為某待測成分對照品i峰面積，Ci為某待測成分對照品i濃度，結果見表2。

表2 相對校正因子（f）計算結果

2.3 相對校正因子的耐用性和系統適用性評價

2.3.1 流速對相對校正因子的影響采用Agilent 1200 高效液相色譜系統和Agilent C18柱，分別考察流速為1.10、1.05、1.00、0.95、0.90、0.80 mL/min 時黃芩苷對其他成分的相對校正因子，結果各成分相對校正因子在不同的流速下重復性良好，結果見表3。

表3 不同流速對相對校正因子（f）的影響

2.3.2 柱溫對相對校正因子的影響采用Agilent 1200 高效液相色譜系統和Agilent C18柱，分別考察柱溫為18、20、25、30、35、40 ℃時黃芩苷對其他成分的相對校正因子，結果各成分相對校正因子在不同的柱溫下重復性良好，結果見表4。

表4 不同柱溫對相對校正因子（f）的影響

2.3.3 不同色譜柱對相對校正因子的影響分別考察依利特Kromasil C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）和Agilent ZORBAXSB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）色譜柱測定時，黃芩苷對其他成分的相對校正因子，結果見表5。

表5 不同色譜柱對相對校正因子（f）的影響

2.4 待測組分色譜峰的定位分別考察保留時間（t）、相對保留時間（r）和相對保留時間差（Δt）在兩種不同色譜柱條件下的穩定性。實驗研究發現采用保留時間時，蘆丁、甘草苷、黃芩苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素的RSD 值依次為4.0%、5.5%、4.0%、2.2%、1.4%、0.8%；采用相對保留時間時，以黃芩苷為內參物，蘆丁、甘草苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素的RSD 值依次為0.1%、1.5%、1.7%、2.5%、3.2%；采用相對保留時間差時，以黃芩苷為內參物，蘆丁、甘草苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素的RSD 值依次為3.9%、2.5%、4.3%、2.3%、2.9%。結果表明采用相對保留時間法RSD 均小于或接近于3.0%，對色譜峰定位較為穩定，因此對待測組分進行定位時宜選擇相對保留時間法。

根據以上考察結果，最終確定蘆丁、甘草苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素的相對校正因子分別為6.426、3.939、3.215、41.140、0.555。

2.5 樣品測定取11 批樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，分別采用一測多評法和外標法（ESM）計算樣品中6 種黃酮類成分的含量，結果見表6。經成組t檢驗，表明通過兩種方法的測定結果差異無統計學意義（P>0.05）。

表6 樣品測定結果/（mg/g）

3 討論

3.1 一測多評法的優勢分析QAMS 技術由王智民等［2］于2006 年提出，通過將性質穩定，價廉易得的化學組分作為內參物，利用各組分之間的函數關系，實現對多個成分含量的同時測定，能從整體上對中藥、飲片及復方制劑的質量進行控制，具有經濟、高效、簡單的優勢［3-8］。隨著分析儀器的迭代升級，目前通過QAMS技術與HPLC、HPLC-MS、UPLC、GC- MS等儀器聯用，使得該技術被廣泛應用在中藥材及其制劑質量的評價，炮制工藝和炮制產品質量的評價、原料中農藥殘留的測定和多成分定量分析等多個方面［9-10］。

3.2 制劑質控指標的確定止血化痔合劑中的黃酮類成分，包括有蘆丁、槲皮素、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、毛蕊異黃酮苷、山柰酚、異鼠李素和甘草苷等數十種，在益氣養血、清熱燥濕、涼血止血消腫等功效中發揮著重要作用。本實驗所選6種黃酮類成分在供試品溶液中含量較高，且藥理活性與止血化痔合劑的功能主治密切相關，其中蘆丁和槲皮素是槐花炭的主要活性成分，可涼血止血、清肝瀉火［11］。黃芩可清熱燥濕、瀉火解毒、止血，具有解熱抗炎、調節免疫等作用［12］，黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素為其主要黃酮類成分。黃芪中含有槲皮素，與升麻合用，補氣以養血［13］。甘草味甘，性平，可補脾益氣、緩急止痛、清熱解毒、調和諸藥［14］，甘草苷為其指標性成分。因此，將這6 種黃酮類成分作為質量控制指標，建立止血化痔合劑多指標定量測定方法，可提高該復方制劑質量控制的整體性和特征性。

3.3 色譜條件的考察和內參物的選擇本實驗采用DAD 檢測器在波長190～400 nm 范圍內掃描混合對照品和供試品溶液，發現6 種黃酮類成分在275 nm 具有較大吸收，且干擾小，故實驗以275 nm為檢測波長。黃芩苷是黃芩的指標性成分，含量較高，其對照品化學性質穩定且廉價易得，便于長期大量分析實驗中使用，因此實驗選擇黃芩苷為內參物進行其他指標性成分的一測多評法定量測定。

3.4 相對校正因子差異情況討論本文以黃芩苷為內參物，計算供試品中黃芩素和漢黃芩素的相對校正因子，分別為41.140、0.555，兩組數據與已報道文獻存在差異，見表7。由于本制劑由9 味中藥材共煎所得，組成較為復雜，考慮由于煎煮過程中成分間相互作用，造成合劑中黃芩素和漢黃芩素的含量差異。此外通過對比過往文獻，黃芩提取物中黃芩素和漢黃芩素的含量，根據其處方組成和制劑類型的不同，計算所得的相對校正因子也存在差異。后續計劃對黃芩單味藥材在相同工藝下進行提取，考察所得藥液中黃芩素和漢黃芩素的含量。

表7 不同參考文獻中黃芩素和漢黃芩素的相對校正因子

研究結果表明，本實驗所建立的6 種黃酮類成分含量測定的QAMS 方法，其計算結果與ESM 測定值相比，差異無統計學意義，但操作簡便，結果重現性和可信度較好，可用于止血化痔合劑的含量測定，為其質量標準完善及質量評價提供參考。