微RNA-223-3p調(diào)控NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3/胱天氨酸蛋白酶-1/白細胞介素-1β信號通路抗小鼠肝纖維化的作用及機制

胡毅翔，左清平，劉任祝，閆慶梓，邢琪昌，劉湘

作者單位：1湘潭市中心醫(yī)院臨床藥學(xué)科，湖南 湘潭 411000；

2長沙市第一醫(yī)院藥劑科，湖南 長沙 410006

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是指肝臟遭到各種致病原侵襲，引起肝臟損害與炎癥反應(yīng)后，導(dǎo)致過度的細胞外基質(zhì)釋放，進而誘導(dǎo)肝星狀細胞活化以及肝臟組織纖維化的病理過程［1-2］。目前臨床尚缺乏治療肝纖維化的有效手段，導(dǎo)致部分病人進展為肝硬化，嚴重影響病人的生活質(zhì)量［3］。MicroR?NAs （miRNAs）是一類高度保守且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的內(nèi)源性非編碼RNA，多項研究表明miRNA與多種類型的肝臟疾病的發(fā)病機制相關(guān)［4］。微小RNA-223-3p（miR-223-3p）具有多種生物學(xué)功能，可抑制肝纖維化的發(fā)生及進展［5］。NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NLRP3）炎性體是NOD 樣受體（NLRs）家族成員之一，同時也細胞焦亡的關(guān)鍵起始位點，對于肝纖維化的進展起促進作用［6］。活化的NLRP3炎癥小體可將胱天氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）剪切成熟，進而促進反向效應(yīng)分子裂解細胞膜，釋放成熟形式的白細胞介素-1β（IL-1β）和IL-18，導(dǎo)致機體產(chǎn)生炎癥，而IL-1β 作為早期的炎性細胞因子在炎癥的發(fā)展過程中起重要作用［7］。本研究自2020 年10 月至2021 年6 月以質(zhì)量濃度為40%四氯化碳（CCl4）腹腔注射誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，以NLRP3/Caspase-1/IL-1β 信號通路為切入點，探究miR-223-3p對小鼠肝纖維化的影響與機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組本實驗共計32只ICR小鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［許可證號SCXK（湘）2020-0006］，體質(zhì)量范圍為18~20 g，所有小鼠均在同一實驗室按照清潔級小鼠要求由專人飼養(yǎng)，保持室內(nèi)溫度為20~24 ℃，相對濕度50%，小鼠自由進食攝水，將32 只ICR 小鼠采用隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、miR-223-3p 模擬物（miR-223-3p agomir）組和陰性對照miRNA 模擬物（agomir-NC）組，每組8 只。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則，經(jīng)湘潭市中心醫(yī)院倫理委員會批準（批號2020-KY-25）。

1.2 試劑和儀器四氯化碳購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司（批號20200106），血清總膽紅素（TBIL）、白蛋白（Alb）、血清透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ?C）購自南京建成生物工程研究所，批號分別為101547、105647、106784、106541、105861；NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白抗體購自美國Santa Cruz 公司，批號分別為S5201RTA、S5410RES、S2144RYU；PCR 引物、miR-223-3p agomir 模擬物（批號20201201）及陰性對照agomir-NC 和陰性對照（批號20201202）購自廣州瑞博生物科技有限公司。

全自動酶標儀（型號WD-2102B，北京六一儀器有限公司），病理圖像分析儀（型號OLYMPUSDP71，奧林巴斯中國有限公司），熒光定量PCR 儀（型號：IQ5，美國Bio-Rad 公司）凝膠成像儀（型號：Gel Doc EZ，美國Bio-Rad 公司），DLAB 高速微量離心機（型號：D1524R，北京大龍儀器有限公司）。

1.3 肝纖維化小鼠模型制備和給藥將ICR 小鼠隨機分為空白組、模型組、miR-223-3p agomir 組和NC antagomir 組，每組8 只，共32 只。建立小鼠肝纖維化模型，建模步驟：采用質(zhì)量濃度為40% CCl4花生油溶液腹腔注射，2 mL/kg，每周3 次，連續(xù)4 周。miR-223-3p agomir 組和agomir-NC 組于第4 周末尾靜脈注射miR-223-3p agomir及agomir-NC（給藥劑量均為200 nmol/L），每周給藥3 次，連續(xù)給藥2 周，空白組和模型組尾靜脈注射等量的生理鹽水。

1.4 血清指標檢測第6周末，各組小鼠禁食12 h，采用摘眼球取血法取血1 mL，于25 ℃靜置0.5 h 后于3 600 r/min 離心10 min，分離血清收集上清液，將上清液裝置干凈的EP 管中進行分裝，置于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩０凑丈噭┖胁僮鞑襟E測定小鼠血清總膽紅素（TBIL）、白蛋白（Alb）、血清透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PC Ⅲ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）含量。

1.5 HE染色及Masson染色小鼠處死后，將肝臟周圍的韌帶組織游離，把肝臟小心取出，在肝乳頭葉處用剪刀剪下一塊2 cm3的肝組織，甲醛固定后制作石蠟切片。依據(jù)HE 染色及Masson 染色試劑盒說明書處理組織，脫水封片后于顯微鏡下隨機選取5個視野拍照，觀察各組小鼠肝組織病理變化。

1.6 纖維化半定量評分用半定量計分系統(tǒng)（SSS）檢測肝臟的纖維化程度，用膠原纖維面積密度對肝纖維程度進行分析［7］。（1）炎癥活動度半定量計分公式為匯管區(qū)炎癥（0~3 分）+小葉內(nèi)炎癥（0~3 分）+碎屑壞死（0~2分）+橋接壞死（0~2分）；（2）纖維化半定量計分公式為小葉內(nèi)炎癥（0~3分）+匯管區(qū)炎癥（0~3分）+纖維間隔數(shù)量×纖維間隔寬度（0~4分）；（3）膠原纖維面積密度：用圖像成像分析軟件對每張切片的5個視野中的纖維面積密度進行測定。

1.7 miR-223-3p靶基因預(yù)測、GO-KEGG分析采用Targetscan 數(shù)據(jù)庫（https：//www.mirbase.org）對miR-223-3p 的靶基因進行預(yù)測及分析，通過Bioinfo數(shù)據(jù)庫（http：//bioinfo. jialab-ucr. org/CancerMIR?Nome/），將miR-223-3p 的治療靶點導(dǎo)入，進行 GO、KEGG 富集分析及功能分析，獲取miR-223-3p 相關(guān)生物進程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）及KEGG富集分析數(shù)據(jù)，評價其生物學(xué)功能。

1.8 實時熒光定量PCR 檢測分別取各組左葉的相同部位組織，超聲粉碎，將組織用胰蛋白酶消化后加入總RNA 抽提試劑（Trizol）裂解提取總RNA，測定濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物序列如表1所示。cDNA 合成過程中采用特異性引物構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)條件為：90 ℃預(yù)變性10 min，38 ℃40 min，90 ℃ 5 s。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAP?DH）為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法對NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達進行相對定量分析。

表1 引物序列表

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測肝組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達分別取4 組小鼠50 mg 肝組織，蛋白裂解液裂解，用玻璃均漿器在冰上對組織進行研磨，30 min 后以12 000 r/min 的速度離心5 min，測定蛋白濃度，每個加樣孔加入60 μg 的蛋白進行分析。電泳2 h 后，采用濕法轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育一抗（Santa Cruz；1∶1 000 稀釋）過夜，次晨采用TBST漂洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（Santa Cruz；1∶3 000 稀釋），37 ℃孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，以GAPDH 為內(nèi)參，采用Quantity One 軟件測光密度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料符合正態(tài)分布，以表示，多組定量數(shù)據(jù)采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗分析，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝纖維化相關(guān)血清標志物檢測與空白組相比，肝纖維化模型組小鼠血清TBIL、Alb、HA、PCⅢ、Ⅳ-C 表達水平均顯著升高（P<0.05），與模型組相比，miR-223-3p agomir 組小鼠血清TBIL、Alb、HA、PCⅢ、Ⅳ-C 均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示miR-223-3p agomir 可降低小鼠血清肝纖維化指標TBIL、Alb、HA、PCⅢ、Ⅳ-C 的表達水平。見表2。

表2 AF對肝纖維化小鼠血清生化指標的影響/

表2 AF對肝纖維化小鼠血清生化指標的影響/

注：TBIL為血清總膽紅素、Alb為白蛋白、HA為血清透明質(zhì)酸、PCⅢ為Ⅲ型前膠原、Ⅳ-C為Ⅳ型膠原。①與空白組比較，P<0.001。②與模型組比較，P<0.001。

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2.2 各組小鼠肝組織HE 染色比較HE 染色結(jié)果如圖1所示，相較于空白組，模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)受損，組織切片中有大量假小葉形成，壞死病灶面積較大，大量的炎性細胞浸潤到肝組織中，細胞排列較亂無規(guī)則。給予miR-223-3p agomir 干預(yù)后，小鼠肝小葉炎癥浸潤情況明顯改善，肝組織內(nèi)浸潤的炎性細胞明顯減少，壞死病灶也顯著減少，大多數(shù)的肝細胞都整齊排列，肝小葉結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，說明miR-223-3p agomir 能明顯抑制肝纖維化的進展，減少炎癥細胞浸潤。

圖1 小鼠肝組織（HE染色×100）：A為空白組；B為模型組；C為miR-223-3p agomir組；D為agomir-NC組

2.3 各組小鼠肝組織Masson染色比較Masson染色結(jié)果如圖2所示，相較于空白組，模型組大量炎性細胞浸潤導(dǎo)致小鼠肝小葉正常結(jié)構(gòu)受損，大量膠原及細胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致肝細胞纖維化，膠原纖維增生嚴重。給予miR-223-3p agomir 干預(yù)后，相較于模型組，小鼠肝臟組織纖維化狀態(tài)顯著改善，肝小葉膠原及細胞外基質(zhì)明顯減少，局灶性壞死組織顯著減少，從而抑制肝纖維化的形成與進展。

圖2 小鼠肝組織（Masson三色染色×100）：A為空白組；B為模型組；C為miR-223-3p agomir組；D為agomir-NC組

2.4 各組小鼠纖維化半定量評分比較纖維化半定量評分比較，模型組小鼠炎癥活動度半定量評分、纖維化半定量評分和膠原纖維面積密度較sham組均顯著升高（P<0.05）；干預(yù)后的miR-223-3p agomir 組小鼠炎癥活動度半定量評分、纖維化半定量評分和膠原纖維面積密度均得到了明顯的抑制，較HF組顯著降低（P<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠肝組織纖維化半定量評分比較/

表3 各組小鼠肝組織纖維化半定量評分比較/

注：①與空白組比較，P<0.001。②與模型組比較，P<0.001。

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2.5 miR-223-3p 靶基因結(jié)合位點及GO-KEGG 分析通過DAVID 數(shù)據(jù)庫，獲取miR-223-3p的治療靶點及相關(guān)生物學(xué)過程分析結(jié)果。GO、KEGG 富集及miRNA-mRNA-KEGG 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，miR-223-3p 可在炎癥、T 細胞免疫、細胞周期等的59 個生命進程中發(fā)揮作用。KEGG 結(jié)果中治療靶點共富集FOXO 信號通路、p53 信號通路、HIF-1 信號通路等12 條信號通路，根據(jù)P 值選出前30 位KEGG 的全部結(jié)果，對選定的GO、KEGG 結(jié)果中P值取?lgP，并作為橫坐標，繪制GO、KEGG 條形圖。Targetscan 數(shù)據(jù)庫對miR-223-3p 靶基因預(yù)測結(jié)果顯示NLRP3 可能為miR-223-3p 的反向靶基因（圖3）。生物學(xué)靶點預(yù)測分析結(jié)果顯示miR-223-3p 可靶向作用于NLRP3，結(jié)合位點如圖4所示。

圖3 富集分析圖：A為GO生物學(xué)功能；B為KEGG通路

圖4 miR-223-3p與靶基因NLRP3結(jié)合位點分析

2.6 實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果與空白組比較，模型組小鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 表達水平明顯上升（P<0.05），與模型組相比，給予miR-223-3p agomir 干預(yù)后，miR-223-3p agomir組小鼠肝組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 表達［（1.24±0.12）比（2.17±0.14）、（1.44±0.11）比（2.65±0.18）、（1.31±0.13）比（1.97±0.21）］均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而給予agomir-NC后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表4。

表4 q-PCR法檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對表達量

2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果如圖5、表5所示，與模型組比較，給予miR-223-3p agomir干預(yù)后，小鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達［（0.89±0.05）比（1.93±0.04）、（1.29±0.07）比（2.15±0.09）、（1.50±0.05）比（2.52±0.12）］均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而給予agomir-NC 后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 表達與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明miR-223-3p agomir 可抑制小鼠肝組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達。

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達情況

表5 q-PCR法檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達量

3 討論

炎癥被認為是宿主對抗病原體的一種防御機制，在相關(guān)刺激下可產(chǎn)生炎癥因子激活固有免疫。炎癥小體是細胞內(nèi)的一種大型多蛋白復(fù)合物，在識別病原體或危險信號后可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的起始，導(dǎo)致細胞膜裂解，釋放多種炎性細胞因子誘導(dǎo)細胞焦亡的發(fā)生及進展［8-9］。NLRP3 炎癥小體主要由NOD樣受體NLRP3，銜接分子凋亡相關(guān)斑點樣蛋白CARD（ASC）以及效應(yīng)分子pro-caspase-1 組成［10］。在細胞內(nèi)外刺激下，NLRP3 炎癥小體被激活并剪切pro-caspase-1，誘導(dǎo)效應(yīng)分子在細胞膜上形成直徑為10~15 nm 的膜孔，進而導(dǎo)致IL-1β和IL-18釋放到細胞外從而促進細胞焦亡的發(fā)生［11］。

肝纖維化早期階段以多種炎性細胞因子和免疫細胞因子浸潤為特征［12］。這一病理過程主要包括3個階段：①愈合階段，②炎癥階段，③重塑階段。這一炎癥過程主要由上皮細胞和內(nèi)皮細胞介導(dǎo)，并觸發(fā)炎癥細胞（包括巨噬細胞、淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞）的募集。NLRP3炎癥小體表達于內(nèi)皮細胞、免疫細胞、肝臟細胞等細胞中，NLRP3/Caspase-1/IL-1β 通路激活后可導(dǎo)致炎癥細胞募集，通過分泌大量的炎癥細胞因子加速肝細胞的炎癥性死亡，進而導(dǎo)致肝纖維化的進展［13］。由于NLRP3 炎癥小體在細胞焦亡中的重要調(diào)控作用，抑制其活化可能為肝纖維化提供潛在的治療策略。MCC950是一種阻斷NLRP3炎癥小體活化的特異性小分子抑制劑。機制上，MCC950 直接與NLRP3 的NACHT 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水解，阻止NLRP3 炎癥小體形成，阻斷經(jīng)典和非經(jīng)典的性NLRP3活化通路［14-15］。研究顯示，miRNA 具有多種生物學(xué)功效，以NLRP3 炎性小體為靶點的miRNA 治療策略是目前肝纖維化治療研究的重點方向［16-17］。

miR-223-3p 由于其廣泛的生物學(xué)作用已成為目前研究者重點關(guān)注的miRNAs 分子。研究表明，miR-223-3p 作為抑癌因子在肝細胞癌細胞中異常低表達，并調(diào)控細胞增殖，同時可發(fā)揮抗炎作用［18］。Ji等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，人環(huán)狀RNA-0070963（Hsa_circ_0070963）可通過調(diào)控miR-223-3p 的表達抑制肝星狀細胞活化及IL-1β、IL-1β等炎癥細胞因子的表達，進而抑制肝纖維化的發(fā)生及進展。另有研究表明，miR-223-3p 可抑制肝細胞炎癥性損傷，抑制細胞外基質(zhì)的沉積［20］。與普通miRNA 模擬物（mimics）相比，miRNA 體內(nèi)模擬物（agomir）與細胞膜親和力更高，特別適合動物體內(nèi)干擾實驗，并且在體內(nèi)實驗中具有更高的穩(wěn)定性和抑制效果，可以采用全身注射或局部注射等多種方式給藥［21］。本項目通過建立小鼠肝纖維化模型，采用靜脈注射的方式給予生物模擬物miR-223-3p agomir，探討miR-223-3p agomir對肝纖維化小鼠的治療作用。

本實驗結(jié)果顯示，miR-223-3p agomir 可顯著抑制四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，降低TBIL、Alb、HA、PC Ⅲ、Ⅳ-C 的表達水平，此外，miR-223-3p agomir 可有效抑制肝纖維化小鼠的炎癥狀態(tài)。HE染色和masson 染色結(jié)果顯示，模型組大量炎性細胞浸潤導(dǎo)致小鼠肝小葉正常結(jié)構(gòu)受損，大量膠原及細胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致肝細胞纖維化，膠原纖維增生嚴重，細胞排列較亂無規(guī)則，給予miR-223-3p agomir干預(yù)后，肝臟組織纖維化狀態(tài)顯著改善，肝小葉膠原及細胞外基質(zhì)明顯減少，局灶性壞死組織顯著減少，表明miR-223-3p agomir 可顯著改善肝纖維化組織炎癥細胞浸潤，降低肝纖維化組織評分，抑制肝纖維化的進展。此外，miR-223-3p agomir 尾靜脈注射可降低小鼠肝組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達水平，表明 miR-223-3p agomir 可抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細胞焦亡通路的激活。綜上所述，過表達miR-223-3p 可抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號通路的激活，降低機體炎癥損傷，改善小鼠肝組織損傷，進而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

（本文圖1~3見插圖8-6）