食管癌細胞中脂多糖對腫瘤壞死因子α誘導程序性細胞死亡配體1表達的影響

胡慧玲，李惠武，朱世茂，楊銀銀，海妮薩依姆·圖爾蓀，王永晨，李卉

作者單位：1新疆醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，新疆維吾爾自治區烏魯木齊 830011；

2粵北人民醫院醫學研究中心，廣東 韶關 512025；

3新疆醫科大學中心實驗室，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊830011

食管癌（esophageal cancer，EC）是常見的惡性腫瘤，在全球腫瘤的發病率與死亡率中分別居第七位與第六位［1］。中國是食管癌高發國家，食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是其主要類型，近年來，食管癌的診斷與治療雖然取得了較大進展，但預后較差，有效治療藥物較少，5 年相對生存率和觀察生存率僅為20.9% 和18.4%［2］。因此研究食管癌的發病機制對其治療及預后有著重大意義。

基于腫瘤學和免疫學的創新與發展，研究［3］發現機體的免疫逃逸與腫瘤的形成密切相關。免疫逃逸是腫瘤存活和發展的關鍵因素，是指腫瘤細胞在增殖和轉移過程中可以通過各種機制逃避免疫系統的識別和攻擊。利用免疫療法阻斷腫瘤的免疫逃逸，恢復機體識別殺傷腫瘤細胞的能力是目前的研究熱點，主要為程序性細胞死亡受體1（pro?grammed cell death protein 1，PD-1）/程序性細胞死亡配體1（programmed cell death ligand1，PD-L1）拮抗劑［4］。導致腫瘤生長和轉移的關鍵是腫瘤免疫抑制微環境，腫瘤細胞過表達PD-L1，通過與活化的T 淋巴細胞表面PD-1 受體特異性結合，抑制免疫反應，使腫瘤細胞逃避機體的免疫監視和殺傷，導致免疫逃逸。在正常的生理條件下通過PD-L1/PD-1 軸抑制免疫反應有助于維持耐受性和自身免疫之間的平衡。因此，PD-L1 是維持免疫穩態的關鍵［5-6］。研究發現，由巨噬細胞產生的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor- alpha， TNF-α）能誘導PD-L1 的表達。在小鼠模型中，PD-L1 的表達在單核細胞成熟為巨噬細胞的過程中明顯增加，并在單核細胞分化為巨噬細胞時達到其峰值［7］。PD-L1 的表達在系統性紅斑狼瘡病人的單核細胞中缺乏，但可以通過外源性添加TNF-α 來重建［8］。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）具有活化巨噬細胞和中性粒細胞、T 淋巴細胞等作用，產生一系列炎癥反應。腫瘤微環境在癌癥轉移中起著至關重要的作用，并顯著影響癌癥病人的治療效果［9］。近年來，大量的研究顯示Jak2/Stat3信號通路的持續激活與腫瘤的發生發展密不可分［10］。

本研究自2020 年5―10 月通過使用LPS 經Jak2/Stat3 信號通路干預TNF-α 誘導的PD-L1，驗證LPS 對PD-L1 的干預作用，為食管癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料人食管鱗癌Eca-109細胞株購自于中國科學院上海細胞庫。Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD 公司；化學發光底物試劑盒（ECL）購自安徽Biosharp 公司；BSA 蛋白檢測試劑盒、彩虹蛋白marker均購自美國Thermo公司；RPMI-1640 培養基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖液（PBS）緩沖液均購自以色列Biological Industries 公司；抗體：p-Jak2、p-Stat3、PD-L1、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG 均購自美國Cell Signaling Technology 公司；β 肌動蛋白（β-ac?tin）購自北京中杉金橋公司；TNF-α細胞誘導因子購自美國Pepro Tech 公司；LPS 脂多糖購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養將人食管癌細胞株Eca-109 培養于含1%青鏈霉素混合液及10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基中，置于濕度飽和、5%二氧化碳、37 ℃的培養箱中。待細胞匯合度為80%~90%時，按比例進行細胞傳代。取生長狀態穩定的細胞以每孔2×106個接種于六孔板中，待細胞貼壁后PBS洗滌并用含1%青鏈霉素混合液及5%胎牛血清的RPMI-1640 培養基換液。將實驗分為空白對照組、TNF-α誘導組、TNF-α+LPS 干預組，培養24 h 后收集細胞，用于后續實驗。

1.2.2 蛋白質印跡法收集已處理的各組細胞，提取總蛋白。使用BCA 法檢測蛋白質濃度，取等量蛋白以10%SDS-PAGE 進行電泳使蛋白分離，濕轉法轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，將PVDF 膜置于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h，孵育單克隆抗體4 ℃過夜，等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗滌后孵育二抗1 h，TBST 再次洗滌，ECL 顯色后凝膠成像設備采集圖像。

1.2.3 細胞凋亡實驗胰酶消化收集24 h 細胞，使用PBS 制成單細胞懸液，調整細胞數為1×106個，參照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，應用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，每組實驗重復3次。

1.3 統計學方法實驗數據使用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS 對Eca-109 細胞中不同時間點p-Jak2、p-Stat3、PD-L1 蛋白表達量的影響使用濃度為100μg/L 的LPS 對Eca-109 細胞進行干預，并在干預15 min 后加入濃度為20 μg/L 的TNF-α 誘導1.5、3、6、12、24 h，收集細胞提取蛋白，應用蛋白質印跡法檢測細胞內p-Jak2、p-Stat3、PD-L1 蛋白的表達水平。結果顯示，與對照組比，經TNF-α 誘導后細胞內p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表達量在24 h明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），提示TNF-α 在誘導PDL1 表達升高的同時激活了Jak2/Stat3 信號通路。與TNF-α 誘導組相比，TNF-α+LPS 干預組的p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表達量在24 h降低，差異有統計學意義（P<0.05），說明LPS 能通過干預Jak2/Stat3 信號通路下調PD-L1的蛋白表達，如表1，圖1所示。

圖1 脂多糖（LPS）干預后腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導Eca-109細胞p-Jak2、p-Stat3、序性細胞死亡配體1（PD-L1）蛋白表達水平變化

表1 LPS干預后TNF-α誘導Eca-109細胞p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表達水平變化/

表1 LPS干預后TNF-α誘導Eca-109細胞p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表達水平變化/

注：TNF-α 為腫瘤壞死因子α，LPS 為脂多糖，PD-L1為程序性細胞死亡配體1。①與對照組相比，均P<0.05。②與TNF-α組相比，均P<0.05。

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2.2 不同濃度LPS 干預對Eca-109 細胞中p-Jak2、p-Stat3、PD-L1 蛋白表達量的影響使用濃度為100、200、400、800 μg/L 的LPS 對Eca-109 細胞進行干預，并在干預15 min 后加入濃度為20 μg/L 的TNF-α 誘導24 h，收集細胞提取蛋白進行檢測。結果顯示，與對照組相比，經TNF-α誘導后PD-L1蛋白表達量明顯升高，同時p-Jak2、p-Stat3的表達量也升高，差異有統計學意義（P<0.05），提示在食管鱗癌Eca-109 細胞中Jak2/Stat3 信號通路是TNF-α 誘導PD-L1 升高的主要細胞內信號傳導通路。與TNF-α誘導組相比，使用濃度為100、200、400、800 μg/L 的LPS 經TNF-α 誘導后進行干預，細胞內p-Jak2、p-Stat3、PD-L1的蛋白表達量均降低，差異有統計學意義（P<0.05），且呈濃度依賴性。如表2，圖2所示。

圖2 不同濃度脂多糖（LPS）干預后腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導Eca-109細胞p-Jak2、p-Stat3、序性細胞死亡配體1（PD-L1）蛋白表達水平變化

表2 不同濃度LPS干預后TNF-α誘導Eca-109細胞p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表達水平變化/

表2 不同濃度LPS干預后TNF-α誘導Eca-109細胞p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表達水平變化/

注：TNF-α 為腫瘤壞死因子α，LPS 為脂多糖，PD-L1為程序性細胞死亡配體1。①與對照組相比，均P<0.05。②與TNF-α組相比，均P<0.05。

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2.3 LPS干預后對Eca-109細胞凋亡的影響使用濃度為100 μg/L的LPS對Eca-109細胞進行干預，并在干預15 min 后加入濃度為20 μg/L 的TNF-α 誘導24 h，收集細胞懸液，用流式細胞儀上機檢測。結果顯示，與對照組（4.77±0.15）%相比，LPS 干預組（8.20±1.65）%細胞凋亡率增加，差異有統計學意義（P<0.05），TNF-α+LPS 干預組（7.63±1.37）%較對照組相比，細胞凋亡率也相應增加，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

食管癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤，由于早期癥狀不明顯，一般發現時到了中晚期，有效治療手段較少，預后差，故病死率高［11］。因此，尋找新的治療方法來提高食管癌病人的生存率尤為重要，免疫治療的問世，提供了研究思路。

免疫逃逸是腫瘤發生發展的重要因素，PD-L1在多種惡性腫瘤細胞中的高表達是常見的免疫逃逸策略，并提示腫瘤治療的預后不良［12］。本研究采用TNF-α 誘導Eca-109細胞24 h，成功建立PD-L1高表達模型，評價LPS 對TNF-α 誘導PD-L1 表達的影響。實驗結果表明LPS 干預能夠顯著降低PD-L1 的蛋白表達，降低p-Jak2、p-Stat3 的蛋白表達水平，同時能促進Eca-109 細胞的凋亡，提示LPS 可能通過Jak2/Stat3 信號通路下調PD-L1 的表達，由此調節腫瘤的免疫逃逸。

近年來，針對靶向PD-1/PD-L1 的免疫檢查點抑制劑對食管癌顯示出較好的療效，部分藥物如納武單抗（nivolumab）已被美國國家綜合癌癥網絡（NCCN）指南納入晚期ESCC 二線治療的標準選擇之一，卡瑞利珠單抗被2020 年中國臨床腫瘤學會（CSCO）指南納入晚期食管癌二線治療的Ⅰ級專家推薦［13-14］。目前，雖然PD-1/PD-L1 抑制劑在多項臨床試驗中表現出較好的療效且有部分藥物已上市，但其臨床應用仍存在相應的局限性，探究其具體作用機制仍需要大量的科研工作。據相關報道［15］，實體瘤可以通過促進腫瘤微環境中的TNF-α 誘導PDL1 的蛋白表達升高，從而抑制機體的正常免疫應答，導致免疫逃逸。研究［16］發現，TNF-α能誘導人結腸癌HCT116 細胞系和人前列腺癌LNCaP 細胞系中PD-L1 mRNA 的表達。另外Donia 等［17］研究發現TNF-α 能促進PD-L1 在黑色素瘤細胞中高表達，從而導致免疫逃逸。本研究采用TNF-α 刺激Eca-109細胞，PD-L1蛋白表達增加，說明模型建立成功。文獻研究［18］報道，TNF-α 能誘導并激活腦周細胞中Jak2/Stat3 信號通路從而導致腦部炎癥。另有研究［19］報道，TNF-α 在腸上皮Caco-2 細胞中的表達與釋放可能通過激活Jak2/Stat3 信號通路導致炎癥性腸病。Jak2/Stat3 信號通路的持續激活與腫瘤的發生發展密切相關，活化后的Jak2/Stat3信號通路能調控下游基因PD-L1 的表達，進而促進腫瘤細胞的增殖與轉移，抑制其凋亡，導致腫瘤的發生發展［20］。本研究結果顯示，Eca-109細胞經TNF-α刺激后高表達PD-L1，同時p-Jak2、p-Stat3 的蛋白表達水平升高，激活Jak2/Stat3 信號通路，說明在食管鱗癌Eca-109 細胞中Jak2/Stat3 信號通路是TNF-α 誘導PD-L1高表達的主要細胞內信號傳導通路，加入LPS 干預后，p-Jak2、p-Stat3、PD-L1 的表達水平下降，說明LPS 能抑制Jak2/Stat3 信號通路的轉導，下調PD-L1的表達，從而抑制食管鱗癌Eca-109 細胞的增殖并誘導其凋亡。提示LPS 可能通過阻斷Jak2/Stat3 信號通路來發揮抗腫瘤效應。

綜上所述，LPS 可能通過Jak2/Stat3 信號通路降低PD-L1的表達，從而誘導食管鱗癌Eca-109細胞的凋亡來發揮抗腫瘤作用，本研究為食管癌的靶向治療提供了新思路。