重癥監護病房耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥基因型及系統進化分析

胡小騫，王琴

作者單位：安徽醫科大學第二附屬醫院醫院感染管理辦公室，安徽 合肥 230601

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）約占醫院重癥監護病房（intensive care unit， ICU）革蘭陰性桿菌感染的15%［1］，是人體內呼吸道和腸道的常見定植菌，易引起免疫力低下病人呼吸道、血液、消化道等部位的感染。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）最初于1996 年在美國的北卡羅來州被Yigit 等［2］發現，隨后傳播至全球各大洲國家。由于碳青霉烯類抗生素的抗菌活性強、抗菌譜廣，近年來臨床治療重癥感染病人時廣泛應用碳青霉烯類藥物，致使CRKP逐年增加，而治療CRKP的抗菌藥物的選擇有限，感染病人的死亡率較高［3］，國內文獻報道為29.53%～76.19%［4］，國外文獻報道為42.14%［5］，給臨床抗感染工作帶來了艱巨的挑戰。近年，我國CRKP 的耐藥形勢逐漸嚴峻，全國細菌耐藥監測網（China antimicrobial resistance surveillance system，CARSS）“2013—2017 年的全國細菌耐藥監測報告”分析顯示，5年期間CRKP檢出率與其他常見耐藥菌的檢出率相比仍處于持續上升的狀態。CHINET（China antimicrobial surveillance network）統計2005—2019年15年的監測數據顯示KP對亞胺培南和美羅培南的耐藥率呈持續上升趨勢（3.0%、2.9%對25.3%、26.8%）［6］。本研究對某三甲醫院ICU 的19株CRKP 進行全基因組測序（whole genome sequenc?ing， WGS），通過分析其耐藥基因型、多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、核心基因組多位點序列分型（core genome multilocus sequence typing，cgMLST）、莢膜型，以及構建最小生成樹（minimum spanning tree，MST）、最大似然樹（maxi?mum likelihood tree，MLT），研究該院ICU內CRKP菌株的分子生物流行病學特點，旨在指導臨床合理使用抗生素，為醫院感染防控措施的落實提供參考依據，遏制多重耐藥菌在院內的播散。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及藥敏鑒定收集安徽醫科大學第二附屬醫院2018 年3—7 月ICU 分離的19 株CRKP，排除同一病人的重復菌株。應用法國VITEK-2 Compat 全自動細菌分析系統和配套試劑GN/GN13，進行革蘭陰性菌的鑒定及藥敏試驗。以大腸埃希菌ATCC 25922，肺炎克雷伯菌ATCC 700603，銅綠假單胞菌ATCC 27853，陰溝腸桿菌ATCC 700323 為質控菌株，質控菌株購自國家衛健委臨床檢驗中心。

1.2 儀器與試劑儀器主要為法國生物梅里埃VI?TEK-2 Compat 全自動細菌分析系統，英國Biochrom超微量分光光度計，上海一恒科學儀器有限公司恒溫培養搖床，美國Bio-Rad 電泳儀，美國Bio-Rad 凝膠成像系統。試劑主要為Oxoid 公司的藥敏紙片、M-H 培養基，DNA Marker D、上海生工生物工程股份有限公司的4S Red plus 核酸染色劑、上樣緩沖液，天根生化科技有限公司的細菌DNA 提取試劑盒。

1.3 菌株DNA 提取挑取CRKP 菌株接種于LB固體培養基上，37 ℃復蘇24 h 后，挑取單克隆菌落于LB 液體培養基中，于37 ℃搖菌過夜。取1 mL 細菌培養液，10 000 r/min 離心1 min，棄上清液，并用DNA提取試劑盒提取細菌DNA。

1.4 基因組DNA 提取物質量控制標準取適量DNA 提取產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用超微量分光光度計檢測純度和濃度。純度要求OD260∶OD280 值于1.8~2.0 范圍內，以避免RNA 干擾；DNA濃度要求數值≥20 μg/L，并且電泳條帶清晰無雜帶，總量于1.0~2.0 μg范圍內。

1.5 細菌全基因組測序運用Illumina Hiseq 2500第二代高通量測序平臺進行2×100 bp Paired-End測序，主要步驟包括對細菌DNA 樣本進行建庫、擴增測序及質控。

1.6 測序結果組裝在Linux 系統中運行SPAdes-2.0 軟件將測序原始FASTQ 結果拼接為FASTA 文件，運行命令參考SPAdes-2.0 軟件網址https：//github.com/ablab/spades。

1.7 耐藥基因型檢測應用staramr 軟件的Res?Finder， PointFinder 和PlasmidFinder 數據庫，通過與數據庫的耐藥基因進行比對，預測菌株攜帶的耐藥基因［7］。

1.8 MLST 分型、莢膜型、cgMLST 分型及MST 構建、最大似然樹構建應用MLST軟件對CRKP基因組的7 個管家基因：gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB進行比對，以檢測CRKP 的ST 型［8］，CRAB 菌株的莢膜型鑒定應用Linux 系統運行Kaptive 軟件檢測。應用Ridom SeqSphere+軟件進行cgMLST 分型及MST 構建，其通過將菌株基因組與www.cgMLST.org 網站上的4 647 個參考核心基因組進行比對，掃描基因序列間的差異，將特定等位基因類型的菌株定義為相應的CT 型（complex type）編號。菌株間的比對結果被可視化以構建MST，相同CT型編號的菌株聚攏為一簇，并對每個菌株的差異等位基因數進行計數，同簇菌株間等位基因差異的閾值為15，差異的等位基因數越少表示親緣性關系越近［9］。

同時，依據全基因組序列的單核苷酸多態性（single-nucleotide polymorphism，SNP）分析，以AY7001 號菌株序列作為參考，應用CGE 的CSI Phy?logeny1.4 工具（網址：https：//cge.cbs.dtu.dk/services/CSIPhylogeny/）及FigTree v1.4.4 軟件構建19 株CRKP 的最大似然樹，按親緣性遠近分組，分析其系統進化關系。

1.9 統計學方法采用WHONET 5.6 軟件對數據進行分析處理，計數資料以率和例數進行描述。

2 結果

2.1 CRKP 的臨床資料19 株CRKP 菌株標本來源分別為痰（16 株84.21%）、腹水（1 株5.26%）、血（1株5.26%）、靜脈導管尖端（1 株5.25%），病人性別分別為男性（14 例73.68%）、女性（5 例26.32%）。見表1。

表1 19株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的分布情況

2.2 CRKP 的藥敏試驗結果19 株CRKP 對頭孢菌素類、青霉素類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、磺胺類等抗菌藥物的耐藥率均為100%，而對替加環素均敏感，耐藥率為0%。見表2。

表2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的耐藥情況

2.3 耐藥基因分析結果19 株CRKP 的WGS 結果顯示，其共攜帶11種耐藥基因和4種質粒，包括3種β-內酰胺酶，19 株（100%）攜帶blaKPC-2、blaTEM-1B，15 株（78.95%）攜帶blaSHV-66；2 種氨基糖苷類中，19 株（100%）攜帶rmtB，17 株（89.47%）攜帶aa?dA2；喹諾酮類耐藥基因只有1 種為qnrS1，19 株（100%）均攜帶該基因；磺胺類耐藥基因有2 種，分別為19 株（100%）攜帶的sul2，17 株（89.47 %）攜帶的sul1；19 株（100%）均攜帶磷霉素耐藥基因fosA6、四環素耐藥基因tet（A）。另外，19 株（100%）CRKP均攜帶四種不同的質粒，包括ColRNAI、IncFII、In?cHI1B、IncR。見圖1。

圖1 19株CRKP的耐藥基因分布

2.4 MLST 分型、莢膜型、cgMLST 分型及系統進化分析結果19 株CRKP 的MLST 分型結果均為ST11 型，其莢膜型結果均為KL64 型，初步結果顯示19株CRKP具有較高親緣性。

通過cgMLST 分型，19 株CRKP 為一個譜型：CT1774 型，同一譜型聚集為一簇，簇中心菌株與周圍菌株具有1~15個等位基因的差異，本研究的中心菌株與周圍菌株具有較近的親緣性關系。MST 圖顯示中心菌株AY7007 與AY7002、AY7005、AY7008、AY7009、AY7010、AY7012、AY7013、AY7014、AY7016、AY7017、AY7018、AY7019 的等位基因差異數為6個以內，親緣性關系較近；中心菌株AY7003 與AY7001、AY7004、AY7010、AY7011 的等位基因差異數為2 個以內，親緣性關系相近；同時，AY7006 與AY7009 的等位基因差異數為5，AY7015與AY7016 的等位基因差異數為2，其親緣性關系相近。見圖2。

圖2 19株CRKP的最小生成樹

19 株CRKP 的MLT 結果顯示，AY7007 位于進化樹的根部，以AY7007 為進化祖先向周圍進化出分支菌株，19 株菌株的進化關系較近。根據分支節點上Bootstrap 值越大該節點置信度越高的判斷標準分為四組克隆型，Ⅰ組為AY7001、AY7003、AY7004、AY7011，Ⅱ組為AY7006、AY7009，Ⅲ組為AY7012、AY7018，Ⅳ 組 為 AY7015、AY7016。見圖3。

圖3 19株CRKP的最大似然樹

3 討論

CRKP 的耐藥機制較為復雜，主要包括產碳青霉烯酶、高產AmpC酶、膜孔蛋白的缺失、主動外排泵過度表達等。其中，產碳青霉烯酶為其主要的耐藥機制，本研究中19 株CRKP 均攜帶β-內酰胺類耐藥基因肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶2 型（β-lactamase Klebsiella pneumonia carbapenemase，blaKPC-2），與碳青霉烯類抗生素亞胺培南、厄他培南、美羅培南（耐藥率均為100%）的藥敏結果相一致，blaKPC-2是一種常見的碳青霉烯類藥物的耐藥基因，于2007年首次在中國一家醫院被發現［10］，KPCs酶通常由質粒編碼，產酶菌株僅對少數抗菌藥物敏感，感染病人的死亡率較高［11-12］。氨基糖苷類耐藥基因中，rm?tB檢出率為100%，aadA2檢出率為89.47%，aadA2檢出率小于阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素的藥敏結果（耐藥率100%），說明aadA2并非引起氨基糖苷類耐藥的主要原因。喹諾酮類耐藥基因qnrS1檢出率100%與環丙沙星、左氧氟沙星的藥敏結果（耐藥率100%）相一致。19株CRKP均攜帶四環素類耐藥基因tet（A）與替加環素耐藥表型（耐藥率0%）并不一致，說明tet（A）不是替加環素的耐藥基因。tet（A）屬于MFS 外排泵，而RND 型外排泵、AcrAB 型外排泵和核糖體蛋白的突變才是導致替加環素耐藥的主要機制［13-14］。同時，質粒在傳播細菌的耐藥性和毒力方面也起著關鍵作用［15］，本研究篩選出四種質粒如ColRNAI、IncFII、IncR、IncHI1B，其中，ColRNAI、IncFII、IncR為耐藥性質粒，19 株CRKP 均攜帶此三種質粒，并同時存在于產KPC-2的ST11型菌株，與Yu 等［16］的研究相符，此三種質粒可能與攜帶blaK?PC-2耐藥基因相關。IncHI1B是一種可攜帶耐藥基因和毒力基因的結合性質粒，國外一家醫院曾報道陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和弗勞地氏桿菌的IncHI1B質粒中均攜帶blaNDM［2］，該質?？稍诓煌N間進行碳青霉烯類耐藥基因的水平傳播［17］。如此嚴峻的耐藥情況和復雜多樣的耐藥基因給臨床抗感染治療帶來了困難，當耐藥菌防控措施落實不當、醫務人員手衛生依從性低、抗生素的使用不合理等情況發生時，耐藥菌將在醫院內、科室間進行傳播流行，將會給病人帶來健康和經濟損失，給社會造成一定的危害。因此，有效的防控措施至關重要。

本研究的19 株CRKP 均為ST11-KL64 型，均攜帶blaKPC-2耐藥基因。ST11 已成為我國CRKP 的優勢克隆型，約占60%百分比［18］。國內有研究曾報道某院的ST11-KL47型CRKP自2016年后發生亞克隆轉移為ST11-KL64 型，系統進化樹顯示ST11-KL64 型由ST11-KL47 型祖系重組所產生。ST11-KL64 型CRKP 感染病人的30 d 病死率高于其他型別CRKP 感染病人，其高毒力表型與生物膜產生較多相關，致使該型抵抗人中性粒細胞的殺滅能力、對大蠟螟幼蟲感染模型的殺滅作用均高于ST11-KL47 型，并且調控黏液表型基因（regulator of mu?coid phenotype gene A，rmpA）的rmpA-rmpA2共同存在于ST11-KL64 型菌株亦使其毒力增強，rmpA-rm?pA2基因通過毒力質粒進行亞克隆轉移，而該型對于干燥環境的抵抗力較強，進一步促進其在醫院內的傳播［19］。blaKPC-2耐藥基因的保守移動元件在質粒上的傳播致使我國CRKP 菌株的廣泛流行［18］。因此，對于攜帶blaKPC-2耐藥基因的ST11-KL64 型CRKP 進行前瞻性主動篩查，提前對感染病人進行主動干預的意義十分重要。

傳統的病原菌分型與溯源方法包括聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）［20-21］等，其中PFGE被視為同源性分析的“金標準”， 但亦具有耗時長、操作難度大、批次間差異性大的缺點［22］。隨著全基因組測序（whole genome sequenc?ing，WGS）技術的迅速發展，及測序成本的降低，WGS 結合生物信息學分析的方法已經廣泛應用于分子生物流行病學研究中，技術方法包括MLST 分型、cgMLST 分型、SNP 等，cgMLST 分型和SNP 具有較好的分辨率、準確性、可比性、可操作性，有利于實驗室間的標準化［23-24］。本研究同時應用cgMLST分型和SNP 兩種方法對19 株CRKP 的親緣性關系進行溯源。其中，基于cgMLST 的Ridom SeqSphere+軟件根據核心基因組等位基因的差異數目生成MST，親緣性關系越近距離越近，并聚集為一簇。本研究MST 圖顯示19 株CRKP 聚集為一簇CT1774型，以AY7007、AY7003 菌株為中心，向周圍菌株進化播散，周圍菌株與中心菌株的等位基因差異數目閾值為15 以內，說明19 株CRKP 的親緣性關系相近。同時，應用FigTree v1.4.4 軟件基于最大似然法的單核苷酸多態性構建MLT圖［25］，結果顯示19株菌株以AY7007 為進化祖先向周圍進化分支，Ⅰ組克隆型的4 株菌株（AY7001、AY7003、AY7004、AY7011）分離自2018 年3 月10 日至4 月11 日，Ⅱ組克隆型的2 株菌株（AY7006、AY7009）分離于2018年5 月2 日、5 月4 日，Ⅳ組克隆型的2 株菌株（AY7015、AY7016）分離于2018 年5 月28 日、6 月6日，這三組組間采樣時間間隔較遠，但組內采樣時間間隔較近。Ⅰ組、Ⅳ組克隆型組內病人床位相鄰，且兩組病人均接受過床旁共用的纖維支氣管鏡檢測，推測可能由于床旁物體表面、纖維支氣管鏡或醫務人員的手等引起病人間的交叉傳播。雖然，Ⅱ組克隆型中病人床位不相鄰；Ⅲ組克隆型的2 株菌株（AY7012、AY7018）分離于2018 年5 月21 日、6月24 日，組內采樣時間間隔較遠，且床位不相鄰或相同，由于CRKP 產生生物膜，生物膜可在醫院的各類導管及醫療設備內、外表面長期存活，能保護病原菌抵抗外界環境變化［26-27］，故Ⅱ組、Ⅲ組克隆型仍不能排除醫務人員的手或共用檢查設備表面引起CRKP的傳播。

由于本研究是針對ICU的醫院感染病例高發情況的調查，因而在菌株收集數目和標本來源方面具有一定的局限性。另外，由于目前缺乏國際通用的細菌基因組數據分析標準化流程，對于判斷暴發克隆的SNP 閾值缺乏統一標準，致使系統進化分析結果難以實現標準化。后續筆者將對以上不足之處進行深入研究，優化病原菌溯源分析策略，完善菌株數目及標本來源，為多重耐藥菌防控工作提供更科學的數據支持。

綜上所述，該院ICU 的CRKP 主要耐藥機制為攜帶blaKPC-2并產KPC 酶；CRKP 分型為ST11-KL64-CT1774型，同源相關性高，存在科內克隆性傳播的風險。

（本文圖3見封三）