電針調控腫瘤壞死因子受體1/受體相互作用蛋白激酶1/核因子κB軸對骶髓損傷后神經源性膀胱尿潴留大鼠尿動力學的影響

盧壯，劉敏，韋艷梅，黃鈺嵐，林靜

作者單位：百色市人民醫院，a康復醫學科，b泌尿外科，廣西壯族自治區 百色 533000

神經源性膀胱（neurogenic bladder， NB）是骶髓損傷（sacral cord injury， SCI）的常見臨床并發癥，SCI 病人中NB 的發生率近乎100%，嚴重影響了病人生存質量［1］。SCI后，受損的神經中樞無法有效調控膀胱逼尿肌及尿道括約肌，極易出現膀胱或尿道功能障礙，最終導致尿潴留，引發反復尿路感染、結石、慢性腎功能衰竭等疾病［2］。電針對神經官能癥、神經痛和神經麻痹等疾病具有較好療效。多項研究結果［3-4］表明，電針療法具有促進損傷脊髓修復、雙向調節膀胱功能及抗泌尿系統感染的獨特功效。筆者前期研究已表明，電針取穴“次髎”“中極”“三陰交”可調控凋亡相關因子的表達，使SCI 后NB 模型大鼠的膀胱功能得到改善［3-4］。炎癥反應與凋亡關系密切。過度炎癥反應可誘發脊髓繼發性損傷，加速神經元凋亡，影響SCI 后神經功能的修復以及膀胱功能。研究發現，電針刺激還可通過抑制炎癥反應改善大鼠SCI后下肢運動功能［6］，提示電針改善SCI 后NB 大鼠膀胱功能的機制也可能與其抗炎效應有關。故本研究擬選取SCI 后NB 大鼠模型為研究對象，探究電針對SCI后NB 尿潴留大鼠尿動力學及炎癥反應的影響及機制。本研究起止時間為2019年1月至2021年12月。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器注射用青霉素鈉（石家莊石藥集團中諾藥業公司，批號H23020930）；乳酸鈉林格注射液（安徽雙鶴藥業公司，批號H20055488）；水合氯醛（上海山浦化工有限公司，批號30037516）；TriQuick Reagent（北京Solarbio 公司）；反轉錄試劑（武漢Monad 公司）；SYBR qPCR Master Mix（安徽Biosharp 公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6） ELISA 試劑盒（上海酶聯生物）；γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒（武漢基因美公司）；腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）、受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）、磷酸化kappa B 抑制因子激酶（p-IKKβ）、kappa B 抑制因子激酶（IKKβ）、核因子κB p65（NF-κB p65）、磷酸化核因子κB p65（p-NF-κB p65）、磷酸化NF-κB 抑制蛋白α（p-IκBα）、β-actin、GAPDH 抗體（英國Abcam 公司）；NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）抗體（美國CST 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京Solarbio 公司）；RIPA 裂解液（北京Solarbio 公司）；WZ-50C6 微量灌注泵（浙江史密斯醫學儀器公司）；SDZ-V 型電針治療儀（蘇州醫療公司）；MP150-WSW 多通道生理記錄儀（美國Biopac 公司）；電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；多功能酶標儀（美國MD 公司）；Real-Time PCR System（美國Agilen 公司）；低溫離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 動物及分組SPF 級SD 大鼠45 只，雄性，體質量范圍為250~300 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。采用隨機數字表法挑選10 只大鼠作為空白組，其余35 只構建SCI 后NB 尿潴留大鼠模型，2 周后確定SCI 后NB 模型成功后隨機數字表法選取30只分為模型組、電針組與電針對照組，每組10 只。動物實驗過程符合動物倫理委員會標準。

1.3 動物模型制備采用脊髓橫斷法并加以改良，構建SCI后NB尿潴留大鼠模型［7-8］：大鼠在手術前禁食12 h；腹腔注射10%水合氯醛（30 mg/kg）麻醉后固定于鼠板上；取大鼠俯臥位，消毒鋪巾；以L2~L3椎間隙為中心切開皮膚，分離肌肉和筋膜；切斷L2~L3棘間韌帶，咬除椎板；用牙科探針挑起并切斷脊髓；止血、縫合、消毒。手術后常規喂養，連續腹腔注射7 d 20 萬U 青霉素防止感染。手術后，大鼠處于脊髓休克期，膀胱會出現尿潴留，每天手法輔助排尿2~3次。手術后第14天，大鼠度過脊髓休克期后，出現前肢可行走、后肢拖動，膀胱無抑制性收縮、膀胱最大容量明顯下降，尿潴留等癥狀，說明SCI 后NB尿潴留大鼠模型構建成功。

1.4 一般情況觀察35 只造模大鼠中，有1 只后肢能自主活動，1只手術后死亡，1只不符合造模要求，共32 只符合造模成功標準，取30 只大鼠隨機分為模型組、電針組和電針對照組，每組10只，納入結果分析。

1.5 電針治療建模成功2 周后行電針治療［7，9］。電針組選取穴位：“次髎”“中極”“三陰交”，電針對照組選取上述3 個穴位的對照點（穴外側旁開0.3 cm 處），兩組針刺操作方法相同，20 min/d，連續7 d。空白組和模型組不進行電針治療。

1.6 尿動力學檢測各組大鼠水合氯醛麻醉后排空膀胱，將F3 導管從尿道導入，用微量灌注泵和MP150-WSW 多通道生理記錄儀勻速（0.1 mL/min）灌注恒溫生理鹽水，檢測并記錄膀胱最大容量（mL）、膀胱基礎壓（cmH2O）、漏尿點壓力（cmH2O）和膀胱順應性（mL/cmH2O）。

1.7 樣本采集和處理各組大鼠完成尿動力學檢測后，水合氯醛腹腔麻醉，以L2~L3椎間隙為中心取上下各約l cm 脊髓組織，生理鹽水洗凈，?80 ℃保存備用。

1.8 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）TRIzol 試劑盒從各組大鼠脊髓組織中提取總RNA，逆轉錄混合底物逆轉錄總cDNA。SYBR Green 法進行PCR 擴增，反應體系；95 ℃ 30 s 變性，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；均重復3 次，結果取平均值，2?ΔΔCt法計算TNFR1和RIPK1的相對表達量。引物見表1。

表1 引物序列

1.9 蛋白質印跡法（Western Blotting）將大鼠脊髓組織勻漿后，離心取上清液，BCA 法測定蛋白濃度，5×Loading buffer 混勻，沸水浴5 min；提總蛋白，行恒壓SDS-PAGE 電泳，轉PVDF 膜；TBST 洗滌，5%脫脂奶粉-TBST 37 ℃封閉1 h，加一抗，4 ℃孵育過夜；加對應HRP 標記二抗，37 ℃孵育1 h，TBST 洗滌，ECL 顯影，Image J 分析條帶，計算TNFR1、RIPK1、p-IKKβ、IKKβ、NF-κB（p65）、p-NF-κB（p65）、p-IκBα、IκBα的相對表達量。

1.10 酶聯免疫吸附劑測定法（ELISA）取適量組織塊，預冷PBS 沖洗，稱重；加預冷PBS（組織與PBS質量體積比為1∶5）于冰上充分研磨；勻漿液5 000×g離心5 min，取上清；嚴格按說明書檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量。

1.11 統計學方法使用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 5 進行數據分析和繪圖，計量資料表示為xˉ ±s。符合正態分布的數據用參數檢驗，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t和SNK-q檢驗；不符合正態分布的數據用非參數檢驗，多組間比較和組間兩兩比較用Kruskal-Wallis 檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠尿動力學檢測與空白組比較，模型組大鼠膀胱最大容量、膀胱基礎壓、漏尿點壓力、膀胱順應性增加，差異有統計學意義（P<0.05）；與電針組治療前比較，電針組治療后膀胱最大容量、膀胱基礎壓、漏尿點壓力、膀胱順應性降低，差異有統計學意義（P<0.05）；與電針對照組治療后比較，電針組治療后膀胱最大容量、膀胱基礎壓、漏尿點壓力、膀胱順應性降低，差異有統計學意義（P<0.05）；電針對照組治療后與治療前比較差異無統計學意義（P>0.05）；電針組及電針對照組治療前與模型組比較均差異無統計學意義（P>0.05）。見表2，3。

表2 大鼠尿動學檢測結果/

表2 大鼠尿動學檢測結果/

注：①與空白組比較，P<0.05。

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表3 大鼠治療前后尿動學檢測結果/

表3 大鼠治療前后尿動學檢測結果/

注：①與治療前比較，P<0.05。②與電針對照組比較，P<0.05。

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2.2 電針對大鼠脊髓組織TNFR1/RIPK1 通路指標表達的影響與空白組比較，模型組TNFR1、RIPK1 mRNA 和TNFR1、RIPK1、p-IKKβ/IKKβ 和p-IκBα/IκBα 蛋白表達升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，電針組TNFR1、RIPK1 mRNA和TNFR1、RIPK1、p-IKKβ/IKKβ 和p-IκBα/IκBα 蛋白表達降低，差異有統計學意義（P<0.05）；電針對照組與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表4，5。

表4 各組大鼠脊髓組織TNFR1、RIPK1 mRNA的表達/

表4 各組大鼠脊髓組織TNFR1、RIPK1 mRNA的表達/

注：TNFR1為腫瘤壞死因子受體1，RIPK1為受體相互作用蛋白激酶1。①與空白組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。③與電針對照組比較，P<0.05。

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表5 各組大鼠脊髓組織TNFR1/RIPK1通路指標蛋白的表達/

表5 各組大鼠脊髓組織TNFR1/RIPK1通路指標蛋白的表達/

注：TNFR1為腫瘤壞死因子受體1，RIPK1為受體相互作用蛋白激酶1，p-IKKβ為磷酸化kappa B 抑制因子激酶，IKKβ為kappa B 抑制因子激酶，p-IκBα為磷酸化NF-κB抑制蛋白α。①與空白組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。③與電針對照組比較，P<0.05。

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2.3 電針對大鼠脊髓組織NF-κB 通路指標表達及炎癥反應的影響與空白組比較，模型組p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達和TNF-α、IL-1β、IL-6、IFNγ 含量升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，電針組p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ 含量降低，差異有統計學意義（P<0.05）；電針對照組與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1和表6，7。

圖1 各組大鼠脊髓組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65的表達

表6 各組大鼠脊髓組織NF-κB通路指標蛋白的表達/

表6 各組大鼠脊髓組織NF-κB通路指標蛋白的表達/

注：NF-κB p65 為核因子κB p65，p-NF-κB p65 為磷酸化核因子κB p65。①與空白組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。③與電針對照組比較，P<0.05。

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表7 各組大鼠脊髓組織中炎癥相關因子的表達/（ng/L，）

表7 各組大鼠脊髓組織中炎癥相關因子的表達/（ng/L，）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-1β為白細胞介素1β，IL-6為白細胞介素6，IFN-γ 為γ干擾素。①與空白組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。③與電針對照組比較，P<0.05。

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3 討論

中醫學將SCI后NB 尿潴留歸于“癃閉”范疇，腎氣不足、正氣虧損、膀胱氣化失司、三焦不能同調水道是其主要病機，膀胱內充滿尿液無法排出。大量研究表明，臨床運用電針治療可雙向調節膀胱功能及抗泌尿系統感染［10-11］。筆者前期研究證實電針取穴“次髎”“中極”“三陰交”治療SCI后NB 大鼠，可一定程度改善受損膀胱組織功能障礙。“次髎”屬膀胱經，主治排尿不利而導致的尿潴留，骶神經（支配膀胱等盆腔臟器）位于該穴下，刺激“次髎”可激活傳入神經元將刺激傳導至脊髓排尿中樞，運動逼尿肌和括約肌節，引發排尿反射?！爸袠O”為膀胱之募穴，是治六腑病的要穴，髂腹下神經（支配膀胱和直腸）位于該穴下，刺激“中極”可收縮膀胱逼尿肌，引發排尿反射，利于膀胱功能調節及氣化?！叭幗弧笔亲闳浗粫ǎ飨陆箽鈾C不通，刺激“三陰交”可通過反射弧傳導至脊髓后跟，刺激腰骶部排尿中樞，引發排尿反射，調節膀胱活動和功能。本研究構建SCI后NB 尿潴留大鼠模型后，大鼠膀胱最大容量、漏尿點壓力和膀胱順應性升高，說明模型大鼠尿潴留現象明顯，膀胱功能障礙，造模成功。利用電針刺激SCI 后NB 尿潴留大鼠次髎、中極、三陰交后發現，膀胱最大容量、漏尿點壓力和膀胱順應性降低，與既往研究結果一致［12-13］，表明電針可改善SCI 后排尿中樞功能，刺激逼尿肌及括約肌活動，降低膀胱內壓、最大容量，減少殘尿量，恢復尿潴留大鼠膀胱功能。

SCI 后神經元和軸突中大量分泌炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 等），過度的神經元炎癥加重了脊髓神經組織損傷，影響膀胱功能恢復，而電針可抑制SCI 大鼠的炎癥反應，促神經系統恢復［14］。研究發現，SCI 后NF-κB 通路在脊髓組織神經組織中異常激活，大量研究表明抑制該通路可減輕神經元炎癥反應，恢復調控功能［15-16］。正常狀態下，NF-κB 在胞質中以IKB-NF-κB p65-NF-κB p50復合物形式存在，受到外界刺激因素（如TNF-α）后，IKBα發生磷酸化，而后被泛素化并降解，NF-κB p65移位入核，誘發一系列炎性因子表達。NF-κB 受到TNFR1/RIPK1 通路的調控，TNFR1 活化后會快速募集RIPK1，激活其下游IKKβ，IKKβ 活化進一步磷酸化IKBα，釋放并激活NF-κB。研究［17］表明，通過抑制SCI 大鼠TNFR1 表達可減少組織損傷及炎癥反應，改善運動功能。但電針能否通過調控TNFR1/RIPK1/NF-κB通路發揮作用尚未可知。

本研究結果顯示，SCI 后NB 尿潴留大鼠脊髓組織TNFR1、RIPK1和p-IKKβ/IKKβ 蛋白表達升高，表明TNFR1/RIPK1 通路在SCI 后NB 尿潴留大鼠脊髓組織中顯著激活；利用電針治療后，TNFR1、RIPK1、p-IKKβ/IKKβ 蛋白表達降低，表明電針可抑制TN?FR1/RIPK1 通路活化。同時我們發現，在應用電針治療后，大鼠脊髓組織p-NF-κB p65/NF-κB p65 及pIKBα/IKBα 蛋白表達降低，提示電針可通過抑制TNFR1/RIPK1通路活化進一步拮抗NF-κB。本研究還進行了NF-κB 下游炎癥相關因子的檢測，發現電針治療可降低大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ 的水平，表明電針治療后，TNFR1/RIPK1/NF-κB 通路被抑制，進而影響下游TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 的表達，減輕神經元炎癥反應，促進神經組織修復，恢復排尿中樞功能，改善膀胱功能。

既往研究證實，電針刺激“中極”“次髎”“三陰交”可顯著改善SCI 后NB 尿潴留，但相關機體機制研究較少，主要為抑制神經元凋亡（如活化PI3K/AKT 通路和拮抗NGF/TrkA 通路），與筆者前期研究發現電針可抑制PTEN/Akt 通路抑制神經元凋亡相似。而對于SCI后脊髓組織中廣泛的炎癥反應和異常激活的NF-κB，電針對其的調控機制尚未見研究。既往研究中，不乏圍繞NF-κB 對電針調控機制的研究，如電針抑制NF-κB 活性改善大鼠認知障礙［18］、治療高血壓性腦出血［19］和潰瘍性結腸炎［20］等。本研究首次發現電針可通過抑制TNFR1/RIPK1 通路拮抗NF-κB 活化，減輕脊髓神經元炎癥反應，重塑部分脊髓神經功能，使逼尿肌和括約肌正常活動，改善SCI后NB尿潴留大鼠膀胱功能。

綜上所述，本研究結果表明電針“次髎”“中極”“三陰交”可改善SCI 后NB 尿潴留大鼠膀胱功能，其機制可能與抑制TNFR1/RIPK1/NF-κB 通路，減輕神經元炎癥反應，促進神經組織修復有關，表明電針在治療SCI 后NB 尿潴留有較好療效，具有明顯抗炎效應，臨床應用價值較高，值得應用、推廣。