棘孢木霉的分離鑒定及其對藍莓生長發育的影響*

付 香，王賀新，王 碟，王 欣，任 瀚，婁 鑫

（大連大學生命健康學院，遼寧 116622）

木霉屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目叢梗孢科，其有性型為子囊菌門糞殼菌綱肉座菌目肉座菌科的肉座菌屬，具有廣譜、高效的抑菌功能活性并且能夠促進植物的生長發育[1-3]。21 世紀以前的研究大多集中在木霉生物防治機制與應用方面，而對木霉促生作用機理的研究較少，近年來木霉作為生物肥料的研究越來越廣泛[4-6]，其主要參與調節植物生長發育[7-9]、降解或抑制根際有害物質的產生[10-12]、提高養分利用效率[13-14]等過程。木霉的次級代謝產物中包含大量植物激素或激素類似物[9]，如吲哚乙酸、赤霉素等，可以參與調節植物的生長發育過程[15-16]。木霉能夠促進土壤養分的循環轉化，能夠產生有機酸促使磷酸鹽溶解[17]，還可以提高植株根際土壤的全磷、有效磷、全氮、水解氮、全鉀、速效鉀含量，增加馬尾松幼苗對養分的吸收利用效率[18]。當植株處于非生物脅迫條件下，木霉的存在可以減少植株活性氧的積累，提高植株對抗非生物脅迫的能力，接種哈茨木霉和綠色木霉后的玉米幼苗可以減輕干旱脅迫和鹽堿脅迫帶來的損傷[19-20]，接種棘孢木霉后的番茄植株也會消除低溫和干旱脅迫帶來的負面影響，只是相較于低溫脅迫，對干旱脅迫的緩解作用更為明顯[21]。不同種的木霉因形態結構和次級代謝產物的差異[22]，導致生物活性和功能發揮存在較大的不同[23]。黃瓜土壤中施用哈茨木霉可以顯著提高黃瓜總根長、根體積、根尖數以及葉片的凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導度和水分利用效率等[24]，施用擬康氏木霉和棘孢木霉可以顯著提高葉綠素、硝態氮含量以及硝酸還原酶活性[25]。長枝木霉菌肥可以顯著提高蘋果砧木的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量[26]。施用綠色木霉可以顯著提高番茄防御酶活性和酚類物質水平等[27]。木霉種類和寄主植物的不同以及土壤中其他微生物的影響都會對木霉促生機理的研究產生一定影響。隨著新的木霉菌株不斷被開發和利用，其作用機制的深入研究和實際應用范圍也在不斷擴展。因此，收集和鑒定木霉屬種類資源并對其促生能力進行測試對木霉資源的開發利用具有重要價值。目前關于木霉促生機理的研究主要集中在蔬菜等經濟作物上，在果樹方面的研究較少，且沒有特定的優良菌種能夠用于生產實踐[28-29]。另外，植株水培條件下關于木霉促生機理的研究也比較少，沒有具體的參考與研究實踐標準。

藍莓是杜鵑花科越橘屬植物，其果實具有較高的營養價值[30-32]。在種植過程中，病菌侵害和水肥施用不當等問題都會降低其果實品質并影響其生長速度[33-35]。藍莓菌根一般認為是歐石楠菌，存在于藍莓根系中，促進藍莓的養分吸收[36-37]，由于藍莓根系不發達，缺少根毛[38]，關于藍莓根際促生菌的研究比較有限，研究起來也比較復雜，收集和開發多種藍莓根際促生菌資源以及研究根際促生菌對藍莓的影響機制都對促進藍莓養分吸收、改善藍莓生長和生理特性具有重要意義。有研究報道稱木霉能夠防治藍莓根腐病[39-40]、促進藍莓的根系分枝，但未見木霉對藍莓植株具體生長和生理特性影響的報道，需要進一步研究。

在前期藍莓水培試驗研究中發現，在相同條件下有白色絲狀真菌侵染的藍莓植株較其他植株生長更為旺盛。從有絲狀真菌侵染的藍莓根系中分離出1 株真菌，對該菌株進行形態學和分子生物學特性研究，將其鑒定分類，并利用水培技術，以3 月生藍豐藍莓幼苗為試驗材料，將該菌株制成1×108cfu/g 孢子懸浮液，研究其對藍莓幼苗生長及生理狀態的影響，以期為藍莓促生菌的研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以前期染菌的藍莓根系為材料進行菌物分離。菌物回接所用的3 月生藍豐藍莓幼苗由大連森茂現代農業有限公司提供。

1.2 木霉的分離與鑒定

取健康無病害的藍莓根系組織，采用組織表面滅菌法將根段進行消毒處理，并將根段放于孟加拉紅培養基中避光培養，設置培養箱溫度為28 ℃，待觀察到根段的剪口處生長出真菌的菌絲之后，在潔凈工作臺上挑取剪口處的菌絲接種到新的培養皿中進行純化，直至得到單一菌株（菌株A）。

將得到的純化菌株A 接種到PDA 平板上，在28 ℃條件下恒溫暗培養；從24 h 之后開始，每隔12 h 測量1 次菌落的直徑并觀察菌落的形狀，記錄菌落的顏色變化。在PDA 培養基上培養24～48 h時，即菌絲還未見孢子產生時，挑取菌絲，使用臺盼藍染液對其進行染色鏡檢，觀察分生孢子梗的形態和特征。培養3 d 后，菌落即可明顯觀察到綠色或暗綠色孢子，挑取菌落的分生孢子同樣使用臺盼藍染液進行染色制片，在低倍和高倍光學顯微鏡下觀察菌株的產孢結構及孢子的形狀和顏色，采用分類學方法進行鑒定[41-42]。

采用改良的SDS 法提取菌株總DNA，PCR 擴增該菌株的ITS 序列。將擴增后產物送交給生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序得到核苷酸序列后，登錄NCBI 與GenBank 數據庫中的核苷酸序列進行BLAST 比對，獲取與其相似度較高的菌種核酸序列。將其從GenBank 數據庫中獲取的序列與測序回來的菌株A 序列導入Mega 7.0 軟件中，構建菌種的系統發育樹，并進行菌種親緣關系的系統發育分析。

1.3 菌株A 對藍莓生長發育影響的研究

試驗地點在遼寧省大連市金州區大連森茂現代農業有限公司溫室大棚。將培養7 d 的菌株A 用無菌水配制成濃度為5×106cfu/g 的孢子懸浮液備用。以3 月生藍豐扦插幼苗為試驗材料，采用水培方式培養，營養液以Hoagland 和Arnon 營養液為基礎，微量元素參照其他通用配方。營養液用無菌去離子水配制，利用硫酸將其pH 值調整為4.0～4.5。試驗首先挑選長勢一致的藍莓幼苗，轉移到普通水培營養液中進行2 周的適應性轉水培養，在此基礎上再次挑選長勢一致的幼苗進行下一步試驗。將5×106cfu/g 孢子懸浮液稀釋成1×108cfu/g 孢子懸浮液。試驗設定2 組，以無菌營養液為對照，以施用1×108cfu/g 孢子懸浮液為菌株處理，各處理15 株。試驗所使用的水培容器為高15 cm、直徑8 cm、容量900 mL 的玻璃制廣口瓶，外部用黑色膜布包裹以避免透光影響根系的生長。在處理后40 d 測定株高、葉面積、根體積以及葉片光合參數，并取樣測定單株生物量及葉片色素、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）、可溶性糖、脯氨酸含量。

使用卷尺（精確到1 mm）測量株高，打孔稱重法測定葉面積。采用LI-6400/XT 光合測定系統于8：30—11：00 測定光合參數：凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導度（Gs），計算水分利用效率（WUE），氣溫18～20 ℃，葉溫22 ℃，光強1 000 μmol·m-2·s-1；于19：00—21：00 暗環境下測定呼吸速率（Rd），氣溫18～20 ℃，葉溫22 ℃，測定部位為從頂部往下數第4片葉，每個處理隨機測3 株，3 次重復。根體積、SOD 活性和MDA、可溶性糖、脯氨酸含量分別采用排水法、氮藍四唑（NBT）光還原法[43]、硫代巴比妥（TBA）法[44]、蒽酮比色法[45]、茚三酮比色法[46]測定。

1.4 數據分析

采用Excel 2016 軟件整理數據并制圖，采用SPSS 26 軟件對數據進行分析，數據均為3 次重復的平均值±標準誤差。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌落形態特征

PDA 培養條件下，菌落生長迅速，培養3 d（圖1-A），菌落會產生比較致密平坦的棉絮狀或致密叢束狀的氣生菌絲，該菌株表面的顏色多呈白色，有非常明顯的同心圓環狀產孢區，并且在同心環上產生稠密的分生孢子，接近中央的分生孢子呈暗綠色。培養7 d（圖1-B），菌落為暗綠色，產生大量分生孢子。

圖1 菌落形態特征

2.1.2 菌落生長速度

從接種24 h 后每隔12 h 測量1 次菌落直徑，如圖2 所示，菌落生長速度較快，產孢量大，能快速擴繁，其中在48～60 h 時間段內菌落生長的速度最快，菌株在28 ℃恒溫暗培養3 d 即鋪滿整個平板。

圖2 菌落生長速度

2.1.3 菌株顯微特征

如圖3 所示，菌絲為有隔分枝，菌絲的寬度為2.1～2.5 μm，分生孢子梗是菌絲的短側枝，菌絲具有長的主軸，側分支呈現較短的分叉，側枝上的分枝對稱或互生，形成二級或三級分枝，分枝角度為銳角或接近于直角，在分枝末端形成類似瓶狀的小梗，末端形成分生孢子團。分生孢子形狀多為卵圓形或橢圓形，簇生于小梗的頂端，長2.5～4.2 μm，寬1.5～3.8 μm，顏色多呈綠色或者無色。根據該菌的形態特征將其初步鑒定為棘孢木霉。

圖3 菌絲和分生孢子

2.1.4 菌株分子鑒定結果

測序得到菌株的基因序列，長577 bp。將所得序列輸入GenBank 數據庫進行BLAST 同源性比對，得出的登錄號為MG781721.1。采用鄰位相連算法（Neighbor-Joining Method）獲得分支系統樹，置信度檢測通過自舉分析（bootstrap），設置自展數據集的次數為1 000 次。使用Mega 7.0 軟件進行統計和聚類分析，將獲得的序列導入Mega 7.0 軟件中，構建菌種的系統發育樹。使用Kimura 雙參數模型計算各序列的分化距離，省略缺少和不確定的位點。系統發育樹（圖4）的結果表明，待測菌株A 與已知的棘孢木霉在同一個分支中。由此進一步證明，待測菌株A 為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。

圖4 基于ITS 基因序列的木霉系統發育樹

2.2 菌株處理對藍莓幼苗生長發育的影響

2.2.1 菌株處理對藍莓幼苗生長的影響

菌株處理對藍莓幼苗的株高和葉面積均無顯著影響，但顯著提高了藍莓幼苗的根體積和單株生物量，菌株處理的根體積和單株生物量分別為對照的1.40 倍和1.62 倍（表1）。

表1 菌株處理對藍莓幼苗生長及生物量的影響

2.2.2 菌株處理對藍莓幼苗葉片色素含量的影響

植物葉片色素含量是植株生理特征的重要指標。菌株處理的藍莓幼苗葉片色素含量相較于對照均有所變化，其中葉綠素a 含量和類胡蘿卜素含量分別為對照的1.26 倍和1.32 倍，且均差異顯著；葉綠素b 含量和總葉綠素含量均與對照差異不顯著（表2）。

表2 菌株處理對藍莓幼苗葉片色素含量的影響 mg/g

2.2.3 菌株處理對藍莓幼苗葉片光合參數和呼吸速率的影響

接種菌株A 對藍莓幼苗葉片的光合和呼吸速率有一定的促進作用。菌株處理的藍莓幼苗葉片Gs、Tr、Ci、Rd 均有改善和提升，其中Gs 和Rd 分別為對照的3.08 倍和1.58 倍，差異均極顯著；Tr 和Ci分別為對照的1.30 倍和1.16 倍，差異均顯著。但菌株處理對藍莓幼苗葉片Pn 和WUE 均未產生顯著影響（圖5）。說明菌株處理可以提高藍莓幼苗葉片的蒸騰速率和呼吸速率，促進藍莓幼苗的氣孔開放和蒸騰作用。

圖5 菌株處理對藍莓幼苗葉片光合參數的影響

2.2.4 菌株處理對藍莓幼苗抗氧化酶和抗逆性指標的影響

菌株處理會影響藍莓抗氧化酶活性和抗逆性指標，對藍莓植株的防御機制起到一定的加強作用。菌株處理對藍莓葉片MDA 含量和可溶性糖含量均有顯著影響，分別為對照的1.28 倍和1.30 倍；而對藍莓葉片SOD 活性和脯氨酸含量均無顯著影響（圖6）。說明菌株處理會改善藍莓幼苗葉片的抗氧化酶活性，增強藍莓幼苗的抗逆性，但對藍莓幼苗葉片SOD 活性和脯氨酸含量均未起到顯著調節的作用。

圖6 菌株處理對藍莓幼苗抗逆性指標的影響

3 討論與結論

根際益生菌的開發與應用是目前國內外研究的熱點，促生機理主要包括調節植物激素水平[47]，合成抗生素、嗜鐵素、溶解酶等次級代謝產物[48]，增強植物對生物和非生物脅迫的抗性[49-50]，活化土壤中養分[51]等。在植物根際促生菌中，木霉菌種類豐富，生長速度快且抗逆性強，世界分布范圍廣泛，可充分體現生物防治劑和生物肥料的特點。在以往傳統的真菌分類學上，一般都是將形態學特征作為主要鑒定標準。本試驗對水培藍莓根系中1 株白色絲狀真菌進行分離和鑒定，經形態學鑒定和分子鑒定，該菌株與棘孢木霉的特征基本一致，將其鑒定為棘孢木霉，并將該菌株用于藍莓水培試驗。

在植株根系施用微生物菌劑能夠促進植株的生長，提高作物產量和品質[52-53]。Yedidia 等[54]在溫室栽培和水培黃瓜系統中接種哈茨木霉可以顯著提高黃瓜根長、根表面積和根尖數量，能夠改善植株的營養吸收狀態，通過研究得出，植物營養水平的提高可能與接種哈茨木霉后根系總體的有益生長效果直接相關。水稻經棘孢木霉浸種后再播種，株高和地上部干重也顯著高于對照[55]，且與對照相比，水稻根際土壤氮含量顯著提高，氮轉化效率也明顯改善，有效促進了水稻生物量和產量的提升。在本試驗中，菌株處理的藍莓幼苗根體積顯著高于對照，單株生物量也明顯增加，這與在黃瓜、水稻中的研究結果一致。可能是施加木霉菌株孢子懸浮液后，木霉不僅可以定殖到藍莓根系中，還能夠活化氮、磷、鉀等養分元素，促使藍莓根系對養分元素的吸收，使得藍莓幼苗的生長明顯提高。

光合作用是植物生長的基礎，能夠反映植物的生長勢[56]，微生物菌劑的施用會對植株光合色素、氣體交換參數以及呼吸速率產生影響[57-59]。在番茄幼苗根際土壤中施用木霉，葉綠素含量顯著提高[60]。與未接種木霉的甘蔗植株相比，接種木霉的甘蔗植株改變了作物營養、葉綠素和類胡蘿卜素濃度，促使植株光合速率、氣孔導度和水分利用效率均明顯增強，這些級聯反應促使了甘蔗根和莖的發育[61]。玉米經木霉菌處理后，葉片的光合色素含量顯著上升，光合特性也顯著增強[19]。本試驗利用營養液水培法，通過施加木霉菌株孢子懸浮液發現，施用木霉能夠顯著提高藍莓幼苗葉片葉綠素a 和類胡蘿卜素含量，增強了藍莓幼苗的光合和呼吸過程，同時促進了葉片氣孔的開放，提高了葉片的蒸騰速率，有利于水分和無機營養的吸收，增加了胞間CO2濃度，促進了葉片的光合碳同化過程，為藍莓植株生長提供更多的有機營養。

根際益生菌可以誘導植物抗病相關防御酶發生變化，增強植物體的抗病防御能力[27]。超氧化物歧化酶是植物體內存在的抗氧化金屬酶[62]，木霉可以對植株SOD 活性產生影響，番茄植株經木霉處理后葉片SOD 活性明顯提高[63]，在本研究中，藍莓葉片SOD 活性相對于對照有所降低，但無顯著性差異，可能是因為木霉施加到藍莓根系，藍莓根部釋放的化學信號吸引木霉在藍莓根部附著、滲透和定殖，形成藍莓根系和木霉的共生體系，木霉寄生到藍莓根系細胞中對藍莓根系細胞有損傷，導致地上部葉片膜系統遭到一定程度的破壞，自由基積累過多。丙二醛是植物體氧化應激的標志物，脯氨酸含量和可溶性糖含量的變化也一直是植物抗逆性研究的重要指標[64-65]。在木霉緩解水稻干旱性脅迫的研究中[66]，木霉定殖導致丙二醛、脯氨酸含量的降低和酚類物質水平的提高，緩解了干旱性脅迫帶來的損傷。本研究發現，當藍莓植株處于非脅迫狀態下，菌株處理顯著提高了藍莓葉片丙二醛、可溶性糖含量，說明木霉可以雙向調節抗氧化酶和抗逆性指標的變化，通過激活和調節植株的防御機制來增強植株應對生物和非生物脅迫的能力，本試驗木霉菌株有利于增強藍莓的抗脅迫能力，提高藍莓的生理特性。

綜上所述，對水培藍莓根系中的絲狀真菌進行分離，并通過形態學鑒定和分子生物學鑒定，將該菌株鑒定為棘孢木霉。在水培藍莓回接培養試驗條件下，該菌株能夠顯著促進藍莓葉片和根系生長，顯著提高藍莓幼苗葉片丙二醛、可溶性糖、光合色素含量，顯著增強藍莓幼苗葉片的光合特性，說明該菌株的促生效果明顯，能在一定程度上改善藍莓幼苗的生長和生理特性。但在田間栽培條件下，木霉對藍莓植株的促生效果會受到土壤中其他微生物的影響，其促生機理及互作機制仍需進一步研究。本研究初步探討了木霉對藍莓生長發育的影響，以期為木霉資源的開發和藍莓栽培中施用微生物菌劑的應用提供理論參考。