藍莓無糖組培關鍵技術因素研究*

陳相濤，陳芳芳，王 方，郇偉偉，李 潔，李小白

（1 杭州木木生物科技有限公司，浙江 311300）（2 杭州市臨安區農業農村局）（3 浙江農林大學化學與材料工程學院）（4 浙江省農業科學院）

藍莓作為兼具營養和保健作用的美味水果，其富含酚類物質如綠原酸，以及典型的黃酮類物質如槲皮素、花青素、兒茶素、表兒茶素等[1-4]。這些物質具有良好的抗氧化活性，具有預防黃斑變性、抗癌、防治阿爾茨海默病[5-7]、降低心臟病風險[8-9]、降低膽固醇[10]等功效。因此，其深受百姓喜愛，被譽為“第三代水果”。藍莓屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium），目前栽培的藍莓主要由4 種藍莓雜交而成，分別為四倍體高叢藍莓、二倍體和四倍體矮叢藍莓、六倍體兔眼藍莓，以及來自多倍體雜交的五倍體和非整倍體藍莓[11-12]。高叢藍莓又可細分為兩大類，即北高叢藍莓和南高叢藍莓[12]。南高叢藍莓需冷量一般為200～400 h，遠遠低于北高叢藍莓800～1 200 h。目前，國內主要栽培的藍莓品種主要是這兩大類。藍莓種植區域從美洲（主要是美國、加拿大和墨西哥）延伸至歐洲（主要是波蘭、西班牙、俄羅斯）、亞洲（主要是中國、日本）和澳大利亞，目前已經擴展至非洲（如贊比亞）。我國藍莓產業雖然起步較晚，但近年來發展迅猛，種植面積逐年增加，全國藍莓栽培面積從2000 年的僅10 hm2發展到2020 年的6.64 萬hm2，一躍成為全球最大的藍莓種植地[13]。因此，近幾年國內對藍莓種苗需求井噴式地暴發。

傳統藍莓種苗繁殖主要靠扦插以及傳統組培，但扦插的效率太低，而且有嚴格的季節限制，無法應用于大規模種苗生產。傳統組培繁殖系數遠高于扦插，而且一年四季皆可進行操作，但其存在一定的缺陷，尤其是成苗后移栽成活率較低一直是最大的問題，而且培養基中的糖分很容易引起污染而造成損失。20 世紀80 年代末，日本學者提出了無糖組織培養技術即光自養組織培養技術[14]。其原理是以輸入二氧化碳氣體作為碳源，以此替代傳統培養基中的糖，讓植物通過光合作用自身合成糖，使試管苗由兼養型轉變為自養型。強制通氣（即通過二氧化碳富集進行氣體交換）使扦插植物的凈光合速率提高了30～40 倍[15]，使幼苗的存活率提高了35%[16]。此類組織培養可在很大程度上提高苗木質量，具有壯苗、加速生長、移栽成活率高等優點[14]。也可節省蔗糖，降低生產成本，降低組培苗污染率，提高馴化移栽苗的效率。目前，人們已經對木本植物杜仲[17]和歐李[18]，以及草本植物紅掌[19]和滿天星[20]等的無糖組培配方進行了研究和開發，包括不同植物生長調節劑種類和濃度、不同培養液濃度等，但尚未有藍莓無糖組培研究的任何報道，亟須對該技術在藍莓中的幾個關鍵技術問題進行探索。在藍莓的常規組培研究中已經發現，IBA、NAA 和ABT 等植物生長調節劑對植株的生根有重要作用[21]，在無糖組培的液體培養基中，這些植物生長調節劑也同樣需要重視。另外，由于無糖組培的特殊環境，固體基質和營養液的配比（固液比）對植株生根也有重要影響。固液比過高，固體基質更容易起到支撐作用，但影響植物的營養吸收；固液比過低，雖然植物更容易吸收營養，但固體基質支撐作用會被減弱，且浪費營養液而增加成本。雖然無糖組培去除了糖和有機質而減少了污染率，但污染現象還是存在，通過抑菌劑可進一步降低污染率。因此，筆者針對植物生長調節劑、固液比以及抑菌劑進行探討，建立了一套實用的藍莓無糖組培方案，為藍莓產業優質種苗生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為杭州木木生物科技有限公司前期生產的綠寶石藍莓常規組培苗，挑選培養60 d 并且生長健壯的藍莓苗進行無糖培養。

1.2 試驗方法

1.2.1無糖基質的準備、接種和培養

以去除有機組分、糖和瓊脂的改良WPM 培養基（杭州木木生物科技有限公司）為基本營養液，以1～3 mm 的蛭石顆粒為固體培養基質。配好的營養液與基質按一定比例混合后，裝入培養容器內，基質厚度為3～4 cm。將配制好的培養基質與容器一起高壓滅菌，滅菌條件為：121 ℃，30 min。在超凈工作臺上，將生長健壯的藍莓增殖苗去除頂部和基部之后，修剪成2～3 cm 的莖段，插入裝有上述基質的無糖盒中，放入培養室內培養。暗培養3 d后，提供光照和二氧化碳。設定培養室內的二氧化碳濃度為0.12%，光照強度為10 000 lx，光照時間為16 h/d，培養溫度保持在（25±2）℃。

1.2.2不同植物生長調節劑及濃度對藍莓苗生根的影響

設計4 個不同植物生長調節劑及濃度處理：T1，改良WPM＋0.1 mg/L IBA；T2，改良WPM＋0.5 mg/L IBA；T3，改良WPM＋1.0 mg/L IBA；T4，改良WPM＋1.0 mg/L NAA。固液比為1.8 L 蛭石＋1.25 L 營養液，pH 值調至5.2 左右。每個處理制備5 個無糖盒，每個無糖盒接種300 株。分別在培養30 d 和60 d時，從每個無糖盒中隨機選取50 株，測量藍莓苗根系數量和長度，計算平均值，并統計生根率。

1.2.3不同固液比對藍莓苗生根的影響

為保證整個生長過程都有充足的水分，設計3個不同固液比處理：T5，1.8 L 蛭石＋1.1 L 營養液；T6，1.8 L 蛭石＋1.25 L 營養液；T7，1.8 L 蛭石＋1.4 L 營養液。營養液為改良WPM＋1.0 mg/L IBA，pH值調至5.2 左右。每個處理制備5 個無糖盒，每個無糖盒接種300 株。分別在培養30 d 和60 d 時，從每個無糖盒中隨機選取50 株，測量藍莓苗根系數量和長度，計算平均值，并統計生根率。

1.2.4不同抑菌劑在無糖組培中的應用

在營養液中分別添加4 種不同的抑菌劑：T8，1 g/L 多菌靈（四川國光農化股份有限公司）；T9，2 g/L 山梨酸鉀（西安晉湘藥用輔料有限公司）；T10，25 mg/L 氯霉素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；T11，2 mL/L 植培凈（杭州木木生物科技有限公司）。營養液為改良WPM＋1.0 mg/L IBA，固液比為1.8 L 蛭石＋1.25 L 營養液，pH 值調至5.2左右。每個處理制備8 個無糖盒，高溫高壓滅菌，滅菌條件為：121 ℃，30 min。經過滅菌之后接種藍莓苗，接種后放入培養室內培養。每隔15 d 觀察污染情況，并記錄污染率。

1.3 數據分析

在植物生長調節劑和固液比的試驗中，根系數量、根系長度和生根率的統計是不計污染個體的。采用SPSS 22.0 軟件對數據進行分析，利用LSD 方法進行統計學檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同植物生長調節劑及濃度對藍莓苗生根的影響

如表1 所示，T1、T2 處理的藍莓苗根系數量、根系長度和生根率均與T3、T4 處理存在顯著差異。在T1 處理培養30 d 的情況下，生根率為0；在培養60 d 的情況下，藍莓苗有生根表現，生根率為61.77%。隨著IBA 濃度的增加，T2、T3 處理的藍莓苗根系數量、根系長度和生根率相較于T1 處理均有顯著提高，T3 處理的這些性狀均顯著優于T2處理。T3、T4 處理的藍莓苗根系數量、根系長度和生根率之間差異均不顯著。這些結果說明IBA 濃度增加能夠顯著改善藍莓苗的生根情況，在1.0 mg/L IBA 的情況下即可達到藍莓種苗的生產需求。2 種植物生長調節劑在1.0 mg/L 濃度下對藍莓苗生根的影響差異不大，對藍莓苗根系生長的促進作用類似。

表1 不同植物生長調節劑及濃度對藍莓苗生根的影響

2.2 不同固液比對藍莓苗生根的影響

如表2 所示，3 個固液比處理的藍莓苗根系數量、根系長度和生根率之間均存在差異。在T5 處理培養30 d 的情況下，生根率為0；在培養60 d 的情況下，藍莓苗有生根表現，生根率為31.85%。T6處理的藍莓苗根系數量、根系長度和生根率均顯著高于T5 處理。T7 處理的藍莓苗根系數量、根系長度和生根率均顯著高于T5 處理；在T7 處理培養30 d 的情況下，藍莓苗的根系數量和生根率均顯著低于T6 處理；在培養60 d 的情況下，藍莓苗的根系數量、根系長度和生根率與T6 處理均無顯著差異。這些結果說明營養液比重的增加顯著改善了藍莓苗的根部性狀，但當營養液過量時，藍莓苗生長中期（30 d）的生根率受到了影響。

表2 不同固液比對藍莓苗生根的影響

2.3 不同抑菌劑在藍莓無糖組培中的應用

4 種抑菌劑對藍莓無糖組培苗的抑制污染效果如表3 所示。在培養15 d 時，4 種抑菌劑處理的藍莓苗均無污染產生。在培養30 d 時，T10 處理的藍莓苗污染率為10.53%，而其他處理的藍莓苗均未發現污染情況。在培養45 d 時，T8、T9 處理的藍莓苗也出現了污染情況，但T8、T9 處理的污染率均顯著低于T10 處理。在培養60 d 時，4 種抑菌劑處理的藍莓苗均出現了污染情況，且污染率存在顯著差異，抑菌效果表現為：T11 處理＞T9 處理≈T8處理＞T10 處理。T11 處理的抑菌效果最好，能夠有效降低污染率至13.65%（圖1）。

圖1 藍莓無糖組培苗和組培盒

表3 不同抑菌劑在藍莓無糖組培中的污染率 %

3 討論

3.1 不同植物生長調節劑及濃度對藍莓苗生根的影響

本研究結果顯示，藍莓無糖組培苗的根系數量和長度均隨植物生長調節劑濃度的增加而增加，說明植物生長調節劑對于組培苗的生根起著關鍵作用。在改良WPM＋0.1 mg/L IBA 培養30 d 的情況下，藍莓苗基本不生根，但隨著培養時間的增加，即使在較低的IBA 濃度下，藍莓苗也開始生根。這可能與培養后期水分蒸發進而提高了IBA 濃度有關。另外，對比2 種植物生長調節劑可以發現，IBA 和NAA在1.0 mg/L 濃度下，對藍莓苗根系生長的促進作用差異較小，均取得了較好的生根效果。這與李子杰等[22]報道的常規組培生根培養基中植物生長調節劑水平相當（改良WPM＋1.0 mg/L IBA）。當然也與許多常規生根培養基的植物生長調節劑水平具有一定差異，例如肖海峻等[21]研究發現，藍莓瓶內最佳生根培養基（1/2 WPM＋2.0 mg/L IBA＋0.2%活性炭）中IBA 濃度達2.0 mg/L，而在程磊等[23]研究的最佳組培苗生根培養基（1/2 WPM＋20 g/L 蔗糖＋0.5 mg/L IBA＋10.0 g/L 活性炭）中，IBA 濃度只有0.5 mg/L，這可能是由于較高的糖為植株提供了充足的碳源，從而減少了其對植物生長調節劑刺激的依賴。植物生長調節劑水平低雖然不容易引起組培苗變異，但會嚴重拉長整個生長周期，造成生根效果較差、根系細弱，不利于種苗生產。本試驗中，在改良WPM＋0.1 mg/L IBA 處理培養30 d 的情況下，藍莓苗基本不生根，而且培養后期根系也較弱。相反，植物生長調節劑水平過高則容易誘導形成愈傷組織和變異，也不利于種苗生產。因此，在本試驗中植物生長調節劑水平控制在1.0 mg/L 以內。文獻已經報道IBA 和NAA 較IAA 的生根促進作用更好，這是因為IAA 易被氧化分解而失效，因此本試驗使用IBA 和NAA 這2 種植物生長調節劑均取得了良好效果。

3.2 不同固液比對藍莓苗生根的影響

在無糖組培中固體基質與營養液的比例是至關重要的，這直接影響植株與營養液的接觸[16]。固液比過高，雖然容易支撐植株，但會影響植物接觸營養液，從而造成其營養吸收困難；固液比過低，雖然植物更容易吸收營養，但固體基質支撐作用會被減弱，浪費營養液而增加成本，更為重要的是容易造成植物根系呼吸困難，導致爛根。本試驗對3個不同固液比進行了研究，發現1.8 L 蛭石＋1.1 L和1.25 L 營養液均對藍莓苗莖段的接種操作較為容易，但1.8 L 蛭石＋1.1 L 營養液的固液比過大，造成植株吸收營養困難，因此影響了其生根率。1.8 L蛭石＋1.4 L 營養液的固液比偏小，營養液偏多，不利于藍莓苗莖段的接種操作。因此，1.8 L 蛭石＋1.25 L 營養液對藍莓無糖組培較為合適，在培養中期有利于生根，并且根系質量最好，但在培養后期，由于水分蒸發，根系生長減緩，藍莓苗生長也開始停滯。而過多的營養液（1.4 L）在培養初期和中期均影響了根系的誘導和生長，還造成了一定的爛根和死苗；培養后期由于水分蒸發，營養液的量趨于合理水平，最終導致1.25 L 和1.4 L 營養液對藍莓苗根部性狀的影響趨同。因此，在利用1.8 L 蛭石＋1.25 L 營養液的實踐操作中，培養后期可以適當地增加營養液來保證植株能夠吸收足夠的營養，以期得到更好的效果。

3.3 不同抑菌劑在藍莓無糖組培中的應用

雖然無糖組培去除了最容易造成污染的糖分和有機組分，但由于無糖盒的面積較大，接種操作過程時間較長，另外接種的組培苗容易攜帶原組培瓶內的有糖培養基，這些因素都有可能造成無糖組培中藍莓苗的污染。因此，需要添加有效的抑菌成分，才能確保植株的正常生長。多菌靈主要干擾病原菌有絲分裂中紡錘體的形成從而影響細胞分裂，以此達到殺菌作用，其對多種真菌都有效果[24]。氯霉素屬廣譜抑菌劑，可作用于細菌核糖核蛋白體的50S 亞基，對革蘭陰性菌以及革蘭陽性菌都有比較強的抑菌作用，但對革蘭陰性菌的作用強于革蘭陽性菌[24]。山梨酸鉀的抑菌機理主要是與微生物酶系統的巰基結合從而破壞許多酶系統的作用，其可有效抑制霉菌、好氧性細菌以及酵母菌活性，還可以防止葡萄球菌、肉毒桿菌以及沙門氏菌等微生物的繁殖，不過對厭氧性芽孢菌還有嗜酸乳桿菌等微生物是無效的，抑制發育作用要強于其殺菌作用[25]。植培凈是一種長效、廣譜、高活性、新型組織培養專用、防菌落污染的抑制劑，其不殺菌，卻能夠抑制菌落在培養基上萌發成菌絲，能夠抑制孢子萌發轉變為菌絲的過程，可使孢子（菌落）一直停留這種形態不萌發，直到組培苗出瓶。本研究使用4 種抑菌劑，用量均按照說明書建議的工作濃度，即發揮作用的有效濃度，研究發現，在抑菌劑作用下，藍莓無糖組培苗的污染率較低，在培養15 d 時，藍莓苗的污染率為0；在培養15 d 以后才陸續有污染情況出現；效果最差的是氯霉素，其培養60 d 時的最終污染率在40%以上；效果最好的是植培凈，培養60 d 時的最終污染率只有13.65%。常規組培中的藍莓莖段作為外植體接種特別容易污染，在接種1周后陸續出現污染現象[26]。在前期試驗中發現，雖然繼代和生根期間的組培污染率有所下降，但其污染率也還是高于無糖組培。在添加抑菌劑后，無糖組培在控制污染的優勢上進一步突出，尤其是組培專用抑菌劑“植培凈”克服了無糖組培中接種量大、接種時間長而產生的污染風險，其控制污染的效果明顯優于其他3 種抑菌劑。

4 結論

藍莓無糖組培技術較常規的組培有較大的優勢。通過去除糖分和有機組分的液體培養基減少了污染，繼而改用大容器培養，通過自然增加植株的適應性，得到較為健壯的苗木。本研究對藍莓無糖組培中不同植物生長調節劑及濃度、固體基質與營養液比例以及抑菌劑的選擇這3 個重要的影響因素進行了研究，發現改良WPM＋1.0 mg/L IBA/NAA 的營養液配方效果較好，1.8 L 蛭石＋1.25 L 營養液的固液比最佳，植培凈的抑菌效果好于其他抑菌劑，在此條件下培養的藍莓苗健壯、根系多、污染率低。