梨多倍體種質資源的鑒定*

齊 丹，田路明，董星光，張 瑩，霍宏亮，徐家玉，劉 超，張小雙，詹俊宇，張思夢，曹玉芬

（中國農業科學院果樹研究所，農業農村部園藝作物種質資源利用重點實驗室，遼寧興城 125100）

梨屬植物以二倍體為主，但是多倍體種質也普遍存在，五大栽培梨系統中均有多倍體材料，如秋子梨系統的安梨、新疆梨系統的紅那禾、白梨系統的海棠酥、砂梨系統的大葉雪、西洋梨系統的Cure等；梨野生種的原生種中沒有發現多倍體，但是在次生種中的杏葉梨、木梨上發現了多倍體[1]。梨多倍體種質資源是進行梨種質創新的重要材料來源，近年來梨多倍體育種收獲頗豐，如56-5-20 與喬瑪雜交育成的三倍體品種龍園洋紅[2]，大鴨梨與雪花雜交選育的三倍體品種華幸[3]，翠冠芽變選育的四倍體品種眾翠[4]，沙01 與南果梨雜交育成的三倍體品種華香酥[5]和華香脆[6]。

植物多倍體的鑒定方法包括形態初選法[7]、細胞學方法（包括染色體計數[1]和細胞核DNA 含量測定[8]）、分子標記方法[9]。目前，梨種質資源倍性鑒定常用的方法為細胞學方法，流式細胞術在梨倍性鑒定和基因組大小估測上均有應用[10]，同時SSR 分子標記根據位點的等位基因數可作為倍性鑒定的依據[11]。本課題組在構建梨種質資源指紋圖譜時發現，部分梨種質資源在至少1 個位點上擴增出3 個等位基因，部分材料在報道的文獻中為二倍體，故與流式細胞術結合對梨種質資源進行倍性鑒定，增加倍性鑒定的準確度，以期發掘新的梨多倍體材料，為梨種質資源創新和遺傳改良提供新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為保存于國家果樹種質興城梨、蘋果圃的100 份梨種質資源（表1），采集嫩葉進行SSR熒光分子標記和流式細胞術分析。

表1 供試梨種質資源

1.2 試驗方法

采用CTAB 法提取梨基因組DNA，SSR 熒光標記引物選用本實驗室篩選的17 對高多態性引物（表2），引物擴增及毛細管電泳參照張小雙[12]的方法。用Attune NxT 流式細胞儀（Life Technologies 公司，美國）對梨種質的嫩葉進行染色體倍性檢測[8]。

表2 供試高多態性引物序列

2 結果與分析

2.1 SSR 分子標記結果

使用17 對SSR 熒光引物對供試的100 份梨種質資源進行指紋圖譜構建，ABI3730xl 遺傳分析儀的毛細管電泳結果顯示，100 份梨種質在至少1 個SSR 位點上擴增出3 個等位基因，其中41 份種質在1 個SSR 位點上擴增出3 個等位基因，11 份種質在2 個位點上擴增出3 個等位基因，5 份種質在3 個位點上擴增出3 個等位基因，43 份種質在4 個及以上位點上擴增出3 個等位基因（表3）。其中多摩1 個SSR 位點的3 個等位基因的電泳結果見圖1。

圖1 多摩3 個等位基因的毛細管電泳圖

表3 供試梨種質資源擴增3 個等位基因的位點數及倍性評價

2.2 流式細胞術結果

通過查閱文獻發現（表3），軟兒、白皮洋、豬頭、武威豬頭、Cure、珍妮阿、黑酸梨、華香酥、華香脆、杏葉梨、敦煌香水梨、路易斯、玉璧林達、昆切克、沙疙瘩、大水核、盧卡斯、安古列姆、龍園洋紅、紅那禾、大葉雪、八月雪、皮胎果、海棠酥、安梨25 份梨種質是三倍體，甜酸、火把、棉梨、延邊磨盤、面梨、紅八里香、官紅宵、武威香蕉、青皮鐘、蜜香、長把酥、其力阿木提、騷梨、六月鮮、窩窩15 份梨種質是二倍體，沙01 是二、四倍體嵌合體或混倍體[1-2,5-6,8,10,13-18]。

用已知的二倍體棉梨作為對照，流式細胞儀測得染色體熒光強度值在50～55 區間出現較高的單峰。三倍體熒光強度值是二倍體的1.5 倍，在75～85 區間出現較高的單峰。依此判斷，帕頓、武威麥梨、墨梨、多摩、秋洋、Tralezitsa、西洋梨×花楸、廣河沙蛋梨、Summer stambol、隴西麻心、白果梨、保65-1、Dr Gyuiot、Beure Hardenpont、樂都軟兒1號、Eldorado、臨夏香把17 份種質經流式細胞術檢測后，其倍性為三倍體，Harbo 種質經流式細胞術檢測為二、三倍體嵌合體，這18 份種質在以往的文獻中未見報道，為新鑒定出的梨多倍體種質。其力阿木提、騷梨、六月鮮、窩窩在已報道的文獻中為二倍體，但在本研究中其擴增出3 個等位基因的SSR 位點較多，經流式細胞術鑒定，這4 份種質為三倍體（表3）。部分樣品的流式細胞儀檢測結果見圖2。

圖2 9 份梨種質資源葉片細胞的染色體熒光強度分布

SSR 熒光標記結果結合流式細胞術鑒定結果發現，在供試的100 份梨種質資源中鑒定出多倍體種質資源48 份（表3）。在1 個SSR 位點上擴增出3個等位基因的41 份種質均為二倍體；在2 個位點上擴增出3 個等位基因的11 份種質，鑒定出4 個三倍體和1 個二、三倍體嵌合體；在3 個位點上擴增出3 個等位基因的5 份種質，鑒定出3 個三倍體和1 個二、四倍體嵌合體；在4 個及以上位點上擴增出3 個等位基因的43 份種質，鑒定出39 個三倍體，只有Abate Fetel、紅酥梅、貴妃、沂源1 號4份種質為二倍體。

3 討論與結論

經流式細胞術鑒定，在17 個SSR 位點上擴增出3 個等位基因的100 份梨種質資源共發現多倍體種質資源48 份，其中已報道的三倍體梨種質資源25 份，二、四倍體嵌合體1 份，新鑒定出的三倍體梨種質資源17 份，二、三倍體嵌合體1 份，與已報道的倍性研究不一致的三倍體梨種質資源4 份，分別是其力阿木提[1]、騷梨[13]、六月鮮[15]、窩窩[1]。前人研究是使用去壁低滲法制備染色體標本，直接對染色體進行計數的方法，本研究中這4 份種質在指紋圖譜中顯示多個SSR 位點有3 個等位基因擴增，懷疑其為三倍體，再結合流式細胞術進行鑒定，理論上倍性鑒定結果應該是一致的，可見有必要對4 份存在爭議的種質進行深入研究。在使用3 個及以上SSR 位點上擴增出3 個等位基因的48 份種質中，共計檢測到43 份梨多倍體種質。可見隨著擴增3 個等位基因的SSR 位點的增加，鑒定出的三倍體的數量也隨之增加，單一的SSR 位點不能準確鑒定梨倍性，電泳結果多出的雜峰可能與儀器的毛細管污染有關，多個SSR 位點可提高鑒定的準確性。將SSR熒光標記技術與流式細胞術結合可準確鑒定梨種質資源的倍性，同時也對梨SSR 指紋圖譜的雜峰進行剔除，提高了梨指紋圖譜的準確度。

自然條件下多倍體植株的產生過程相對緩慢且較為罕見[19]。近年來，梨多倍體種質的人工選育收獲頗豐，梨屬植物的三倍體來自四倍體和二倍體的雜交[20]，四倍體與二倍體雜交可實現大規模制種，且從三倍體產生效率來看，2n 雌配子更有優勢[21]。如近年育成的三倍體梨品種華幸、華香酥和華香脆，均采用四倍體種質作母本、二倍體種質作父本。梨屬植物的四倍體通常來自芽變，有二倍體品種經芽變選育出四倍體品種，如翠冠的四倍體芽變品種眾翠，鴨梨的四倍體芽變品種大鴨梨，也有利用秋水仙素離體誘變西洋梨品種產生的同源四倍體[22]。

培育多倍體植物會帶來一些好處，會增加果實大小和增強植株抗性，但同時三倍體植物產生的不育花粉比率很高，育性較低，可能對果實生產或育種造成問題，特別是在育種者不了解其倍性的情況下[23-24]。對梨種質資源進行倍性鑒定是梨種質資源評價的基礎工作之一，本研究對保存在國家果樹種質興城梨、蘋果圃的梨種質資源進行倍性鑒定，發掘出多份梨多倍體種質資源，補充和完善了梨種質資源數據庫，可為梨育種工作者提供育種指導。