神經發育損害早產兒腸道菌群變化的前瞻性隊列研究

李燕 陸斯良 莫艷 經連芳 姚麗平 譚偉 韋秋芬

（廣西壯族自治區婦幼保健院新生兒醫療中心/廣西兒科疾病臨床醫學研究中心，廣西南寧 530003）

神經發育損害（neurodevelopmental impairment，NDI） 是一組由中樞神經系統（central nervous system，CNS）生長發育異常所導致的復雜疾病，包括運動、認知、語言發育遲緩等［1］。早產是導致NDI 的一個重要因素，胎齡越小NDI 發生率越高。本項目組前期多中心研究發現，廣西地區胎齡＜28周早產兒NDI 的發病率高達35.9%［2］，形勢嚴峻，但目前NDI 的治療缺乏有效手段，仍以預防為主，嚴重影響著兒童的健康和生活質量，已成為廣西地區新生兒科醫師重點關注的一個臨床問題。

腸道菌群被認為是人體的第二個基因組，已有研究證實了它與CNS 之間的潛在聯系，二者可通過內分泌/神經、免疫和直接的神經作用進行雙向“溝通”，即微生物-腸-腦軸［3］。在生命早期，腸道內的微生物對CNS 的發育至關重要，大腦內小膠質細胞的成熟、突觸的發生、軸突的生長等過程都與腸道菌群關系密切［4］。與足月兒相比，早產兒腸道菌群多樣性低、定植速度慢、成熟晚，易受外界因素影響，導致菌群的定植與發育模式發生改變［5-6］。現有的研究結果表明，精神分裂癥譜系障礙（乳桿菌屬等豐度增加）、孤獨癥譜系障礙（雙歧桿菌屬等豐度減少）及注意缺陷多動障礙（雙歧桿菌屬等豐度增加）等NDI的發生發展與早期腸道內菌群的失調相關聯［7-9］，但受研究設計、樣本數量及地域等因素的影響，此類的研究結果存在異質性。目前國內外關于NDI早產兒腸道微生物組特征的研究主要為橫斷面研究，難以系統地、詳盡地了解菌群的演替過程，因此，為探索腸道菌群與疾病之間的關聯性，縱向性的研究是必要的。

本研究采用了前瞻性、縱向、單中心隊列的設計，收集多個時間點早產兒的糞便樣本，應用高通量測序技術分析NDI與非NDI早產兒之間腸道菌群的差異，旨在豐富NDI早產兒腸道菌群結構的研究數據。本研究對揭示腸道菌群與早產兒NDI之間的聯系，拓展早產兒NDI防治的新思路具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組

本研究為前瞻性、縱向、單中心隊列研究，選取2019年9月1日—2021年9月30日我院新生兒重癥監護室（neonatal intensive care unit，NICU）收治的胎齡＜32 周且出生體重＜1 500 g 的早產兒為研究對象。在糾正胎齡1.5～2歲時行格塞爾發育量表評估，動作能、應物能、言語能、應人能任何一部分得分＜76分納入NDI組，反之為正常組。本研究得到我院醫學科研與臨床試驗倫理委員會批準（桂婦保院醫倫快審2019-4號），新生兒父母或法定監護人知情同意。

納入標準：（1）胎齡＜32 周，體重＜1 500 g；（2）生后立即轉入NICU 治療；（3）新生兒父母或法定監護人簽署知情同意書。排除標準：（1）窒息或診斷為缺血缺氧性腦病；（2）中樞神經系統感染；（3）磁共振成像檢查提示存在大腦發育異常或畸形；（4）遺傳代謝性疾病；（5）急、慢性膽紅素腦病；（6）明確頭顱外傷；（7）自動出院或死亡。

1.2 一般資料采集

采用自制的廣西胎齡＜32周早產兒病例資料收集表采集早產兒的相關資料，包括父母及新生兒出生基本信息、圍生期情況、母親孕期情況、疾病及診治情況、出院及預后等。

1.3 糞便標本采集

采用一次性無菌糞便凍存管收集出院前1 d、輔食添加前1 d 及糾正胎齡1 歲3 個時間節點的糞便樣本，在1.5 h內轉移至-80℃保存待用。

1.4 樣本DNA提取及測序

采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，U.S.）試劑盒提取DNA，NanoDrop 2000檢測DNA濃度及純度，-20℃保存備用。PCR擴增16S rRNA-V4 區，引物序列為338F （5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） 和 806R （5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。PCR 產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences， Union City，CA，USA）進行回收產物純化，檢測定量后使用Illumina MiSeq PE300 平臺上機測序，測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.5 生物信息學分析

測序數據采用FLASH 軟件將序列進行拼接，用Uparse 軟件過濾嵌合體，獲得優化數據后使用序列降噪方法（DADA2/Deblur 等）處理，獲得擴增序列變體（amplicon sequence variant，ASV）代表序列和豐度信息，隨后分析菌群多樣性及組成。

1.6 統計學分析

使用SPSS 23.0 軟件進行統計分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗；非正態分布的計量資料以中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料采用例數和率或構成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況

本研究共納入455 例極低出生體重（very low birth weight，VLBW）早產兒，中途失訪68例，隨訪387 例，排除糞便樣本采集不全172 例，最終入組215 例，其中正常組115 例，NDI 組100 例。住院期間經磁共振成像檢查，除NDI組的2例早產兒有少量腦實質出血，在隨訪期間出現腦軟化外，其余早產兒均未見明顯異常。兩組早產兒性別、胎齡、出生體重、出生頭圍、出生身長等一般情況比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組早產兒一般情況比較

2.2 糞便樣本收集及ASV分析

共收集糞便樣本645 份，其中正常組在3 個時間點各115 份，NDI 組各100 份。兩組早產兒在ASV水平上的Venn圖結果如圖1所示，整體上正常組所獨有的ASV 數量更多，3 個時間點分別獨有602、1 134、712 個物種，NDI 組則有613、595、544個物種，6個亞組所共有的物種數量為308個。

圖1 兩組早產兒在不同時間點的ASV 分類學水平物種Venn圖 不同顏色代表不同的分組，重疊部分（白色）表示多個分組中共有的物種，未重疊的部分表示該分組特有的物種，數字表示對應的物種數目。M 表示正常組，N 表示NDI 組，數字1、2、3分別對應出院前1 d、輔食添加前1 d、糾正胎齡1歲。

2.3 物種多樣性分析

2.3.1 α 多樣性分析 NDI 組早產兒Shannon 多樣性指數在糾正胎齡1歲時高于正常組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組早產兒Shannon多樣性指數比較 （± s）

表2 兩組早產兒Shannon多樣性指數比較 （± s）

注：［NDI］神經發育損害。

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2.3.2 β多樣性分析 主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）顯示，屬水平上兩組早產兒腸道菌群的組成在出院前1 d 時相似（R2=0.008，P=0.130）。至添加輔食前，菌群的結構出現差異，可在一定程度上區分兩組樣本（R2=0.035，P=0.001），其中PC1可解釋24.51%的差異。在糾正胎齡1歲時，兩組早產兒腸道菌群的組成已出現明顯的差異（R2=0.022，P=0.003），在PCoA圖中可區分大部分樣本，其中PC1 可解釋25.80%的差異。見圖2。

圖2 兩組早產兒在3 個時間點的腸道菌群屬水平PCoA 分析 A、B、C 圖分別對應出院前1 d、添加輔食前1 d、糾正胎齡1歲，藍色圓點表示正常組，紅色三角形表示NDI組，每個小圖形代表1個樣本，置信橢圓水平為95%，橫坐標表示主坐標成分1，縱坐標表示主坐標成分2，分析采用Bray-Curtis距離算法。

2.4 物種組成及差異分析

門水平上，兩組早產兒均以放線菌門、變形菌門、厚壁菌門為主，占全部菌門的90%以上。在3個時間點上，正常組早產兒的優勢菌門分別為變形菌門（49.21%）、厚壁菌門（33.96%）、放線菌門（38.72%）。NDI組早產兒除了出院前1 d以變形菌門（44.26%）為優勢菌門外，其余時間點均以放線菌門（輔食添加前1 d：43.57%，糾正胎齡1歲：49.85%）為主，見圖3A。

圖3 兩組早產兒菌群組成分布條形圖 A圖表示門水平分布條形圖，B圖表示屬水平分布條形圖，圖例從上至下按照相對豐度由大到小排序，M 表示正常組，N 表示NDI 組，數字1、2、3 分別對應出院前1 d、輔食添加前1 d、糾正胎齡1歲，屬水平上僅展示豐度排行前15的物種。

屬水平上，正常組和NDI組早產兒各時點腸道內菌群主要由雙歧桿菌屬、大腸埃希菌屬-志賀菌屬、腸球菌屬、克雷伯氏菌屬、未分類腸桿菌屬、鏈球菌屬、狹義梭菌屬1及乳桿菌屬組成，多數以雙歧桿菌為優勢菌屬。隨著時間的增長，兩組早產兒腸道內的雙歧桿菌的豐度逐漸增加（正常組3個時間點分別為16.38%、26.07%、36.24%；NDI組分別為21.46%、40.97%、46.64%），一些條件致病菌如克雷伯氏菌、腸球菌的豐度則逐漸降低。見圖3B。

NDI組腸道內雙歧桿菌屬豐度在3個時間點均高于正常組（出院前1 d：Z=-2.162，P=0.031；添加輔食前1 d：Z=-3.729，P＜0.001；糾正胎齡1歲：Z=-2.429，P=0.015），腸球菌屬的豐度在輔食添加前1 d、糾正胎齡1 歲時也高于正常組（Z=-3.687，P＜0.001；Z=-2.782，P=0.005）。正常組3個時間點腸道內嗜黏蛋白阿克曼菌（以下稱Akk菌）屬的豐度分別為1.0%、3.6%、3.0%，NDI組分別為0.7%、0.5%、0.1%，在輔食添加前1 d時差異具有統計學意義（Z=-3.250，P=0.002）。見圖4。

圖4 兩組早產兒各時點屬水平群落組成差異柱狀圖 A、B、C圖分別對應出院前1 d、添加輔食前1 d、糾正胎齡1歲，圖中左半部分表示物種豐度占比，不同顏色代表不同分組，右半部分則表示兩組相比物種豐度的差值，圓點顏色顯示為物種豐度較大的分組。最右側為P值，*0.01＜P≤0.05，**0.001＜P≤0.01，***P≤0.001。

以屬水平的角度進行線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA），出院前1 d 時造成兩組早產兒腸道菌群結構存在差異的主要菌屬為雙歧桿菌屬（LDA=4.57）、皮桿菌屬（LDA=4.24）及難辨梭菌屬（LDA=4.32）；添加輔食前1 d 為Akk菌屬（LDA=4.20）、雙歧桿菌屬（LDA=4.85）、腸球菌屬（LDA=4.57）；糾正胎齡1 歲時為雙歧桿菌屬 （LDA=4.70）、 腸球菌屬 （LDA=4.31）。見圖5。

圖5 兩組早產兒各時點LDA判別柱形圖 A、B、C圖分別對應出院前1 d、添加輔食前1 d、糾正胎齡1歲，LDA閾值設定為LDA＞4，圖中所展示的是差異有統計學意義的物種。

3 討論

生命早期的1 000 d 是大腦發育的一個關鍵時期，抗生素的應用、飲食和環境等因素都有可能通過微生物-腸-腦軸的“溝通”間接影響這一過程［10-11］。本研究發現，NDI 組早產兒腸道菌群的Shannon 指數在糾正胎齡1 歲時顯著高于正常組，但此時兩組早產兒的腸道菌群仍處于發育階段，菌群的多樣性在接下來的時間里仍會發生明顯變化［12］，因此還難以對NDI 早產兒菌群的多樣性特征下定論。

門水平上，兩組早產兒腸道內菌群主要由放線、變形、厚壁3 大菌門組成，這與LaTuga 等［13］的研究結果一致。正常情況下，人類腸道內最先定植的菌群通常為兼性厭氧菌，隨著氧氣的消耗，嚴格厭氧菌如擬桿菌等才得以大量定植，之后便逐漸成熟形成以厭氧菌為主導的菌群結構［14］，因此正常足月兒腸道內擬桿菌門通常占比較高，從這一角度來看，VLBW早產兒的腸道環境可能并不適合擬桿菌生存。從屬水平上分析，兩組早產兒腸道內檢出8 種主要的核心菌屬，與Seki 等［15］的研究結果相似。該團隊還發現克雷伯氏菌在腸道中過度生長是腦損傷的一個高度預測因素，然而在本研究中并未發現這一現象，且兩組早產兒克雷伯氏菌在任一時間點相比差異均無統計學意義，其可能的原因是醫療環境等因素的影響。兩組早產兒對比后發現，NDI組腸道內雙歧桿菌屬豐度在3個時間點均顯著高于正常組，一些條件致病菌如腸球菌屬豐度也顯著增加。此外，PCoA分析顯示，出院前1 d兩組早產兒腸道菌群結構相似，出院后由于接觸了復雜的自然環境，菌群組成差異便可明顯區分開來，以上結果表明兩組早產兒腸道菌群可能存在著不同的定植和發育模式。

值得注意的是，本研究中兩組早產兒都出現了以雙歧桿菌為優勢菌屬的結構，這可能是因為NICU 內廣譜抗生素和益生菌的應用。VLBW 早產兒因其免疫系統發育相對不成熟，易并發各種感染，NICU 內應用抗生素的現象十分常見，長期抗生素應用可導致腸道內物種數量及豐度顯著下降，在此基礎上應用益生菌，菌群將逐漸過渡并轉變為以雙歧桿菌為主導的結構，然而這種早期建立起來的菌種將在生命后期占據重要的生態位［16］，整個過程相當于“重塑”了菌群的組成。雙歧桿菌對兒童腸道的健康和免疫系統十分重要，它有助于加強腸道屏障功能并可能通過調節神經活性物質發揮腦保護的作用［17-19］。Beghetti等［20］研究發現，VLBW早產兒出生后1個月腸道內雙歧桿菌豐度的降低與遠期NDI的發生存在關聯，然而在本研究中早產兒腸道內雙歧桿菌豐度的增高似乎不能預測或阻止NDI的發生，這可能與診療操作和觀測時間點的不同有關，因此本研究還無法確定雙歧桿菌在NDI中的作用。本研究還發現，NDI組早產兒腸道內Akk菌的豐度始終低于正常組，Akk菌是一種腸道共生菌，正常情況下在生后逐漸增加，在宿主平衡健康與疾病的過程中起著重要作用，已有研究證明了Akk 菌的缺乏與多種疾病如炎癥、肥胖相關聯，同時也包括了CNS 疾病［21］，證明了腸道內Akk菌與大腦之間的聯系，而Akk菌是否在NDI的發生發展中起到了關鍵作用？還需要更深入的研究來證明。

綜上，在糾正胎齡1歲時，NDI組早產兒腸道內菌群的多樣性顯著高于正常組；NDI組腸道內雙歧桿菌屬豐度在3 個時間點均顯著高于正常組；Akk 菌屬豐度均低于正常組，僅在添加輔食前1 d差異有統計學意義。此外，NDI組腸道內腸球菌屬豐度在添加輔食前1 d 和糾正胎齡1 歲時顯著高于正常組；造成兩組早產兒菌群存在差異的主要菌屬為雙歧桿菌、Akk菌和腸球菌。總之，本研究結果表明NDI與非NDI早產兒腸道菌群的組成存在顯著差異。本研究也存在一些局限性：首先，僅設計了3個糞便樣本收集的時間點，無法更好地觀察NDI早產兒腸道菌群的演替過程，未來應增加早期（如6 個月內）及糾正胎齡2、3 歲時等觀察時間點；其次，VLBW早產兒個體間腸道菌群存在高度變異，本研究的樣本量有限，菌群的多樣性和構成分析可能存在偏倚，還有待后續更大規模的隊列研究；最后，本研究僅為16S rRNA 的描述性研究，無法對腸道內菌群的代謝產物變化和相應的分子機制作出分析，這有待更深入的研究以揭示腸道菌群在NDI中的潛在作用。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。