基于VIGS 技術干擾病毒RNA 防控煙草黃瓜花葉病毒病

郭玉鴿，張倩，楊惠娟，李俊營，常棟，張富生，武兆云，閻海濤，楊鐵釗

(1. 河南農業大學煙草學院，河南鄭州 450002；2. 河南省煙草公司平頂山市公司，河南平頂山 467000)

由黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)引起的花葉病是煙草上的重要病害，嚴重影響煙葉質量[1，2]。 黃瓜花葉病毒是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員，為三分體正義單鏈RNA 病毒[3]，編碼5 種蛋白[4]。 RNA1 編碼1a 復制酶蛋白[5]；RNA2 的5′端編碼2a 復制酶蛋白，3′端編碼2b 蛋白[6]。 前人研究發現植物受CMV 侵染后的癥狀表現是由1a 和2a 復制酶蛋白共同決定的，二者具有協同作用[7]。 RNA3 的5′端編碼胞間運動蛋白(MP)，3′端編碼外殼蛋白(CP)，與病毒擴散、長距離運輸和包被作用有關[8]。 目前生產上防治煙草黃瓜花葉病毒病通常以化學防治為主，容易造成藥劑殘留和環境污染等問題[9，10]。 培育抗病品種也是防治煙草黃瓜花葉病的有效方式之一[11]，但至今還沒有從煙草上克隆出CMV 抗性基因[12]，育種工作進展緩慢，而生物防治技術已經逐漸成為病害防治的新方法[13]。

病毒誘導基因沉默(virus－induced gene silence，VIGS)是一種對植物進行反向遺傳操作的技術[14]，是植物防御機制的表現[15]。 農桿菌介導的VIGS 技術通過農桿菌將攜帶目的基因片段的病毒載體轉移到植物細胞中[16]，介導靶向同源基因的mRNA 降解，引起目的基因沉默[17]。 煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus， TRV)載體是使用最廣泛的VIGS 載體，具有沉默效率高、持久性長、不會對宿主造成明顯傷害等優點[18]。 目前VIGS 技術多用于基因功能鑒定和抗病抗蟲[19，20]研究上:如龔攀[21]構建的甜菜VIGS 體系驗證了抗旱相關基因功能；劉天波等[22]沉默馬鈴薯Y 病毒脈壞死株系外殼蛋白基因有效防治馬鈴薯Y病毒病。 有研究表明，CMV 在不同作物中起關鍵作用的基因是不同的[23]。 因此本研究根據CMV基因組及其編碼蛋白的組成特征，構建靶向相關基因片段的TRV 載體，比較煙株接種VIGS 載體后對CMV 的抗性，以期篩選適用于大田防治煙草黃瓜花葉病的最佳VIGS 體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022 年4—5 月進行。 參試烤煙品種為中煙100，由河南農業大學煙草學院育種實驗室提供。 pTRV2 載體購自武漢淼靈生物科技有限公司，根癌農桿菌GV3101 感受態細胞購自上海唯地生物技術有限公司。 CMV 病毒葉片由河南農業大學煙草學院育種實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據已測定的CMV(GenBank登錄號:GCA＿000864745.1)序列，選取適合用來構建VIGS 載體的片段，使用Oligo 7 軟件設計特異性引物，其序列如表1 所示。

表1 本研究使用的引物序列

1.2.2 VIGS 載體的構建 利用TRIzol 法提取感染了CMV 病毒的煙葉總RNA，參照北京全式金生物技術有限公司TransScript One－Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 說明書反轉成cDNA。 以獲得的cDNA 為模板，按照表1 引物利用諾唯贊生物技術有限公司的P505 高保真酶進行PCR 擴增。 擴增體系:2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix(10 mmol/L) 1 μL，Phanta Max Super－Fidelity DNA Polymerase 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，cDNA(20 μmol/L)模版1 μL，ddH2O 補至50 μL。 反應條件:95℃預變性3 min；95℃變性15 s，68℃退火15 s，72℃延伸30 s，35 個循環；72℃終延伸5 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化回收目的片段。 對pTRV2 空載體質粒進行EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后獲得線性化載體。將擴增產物與線性化載體進行連接，隨后轉化至大腸桿菌DH5α 感受態細胞。 將測序正確的單克隆菌株擴繁并提取質粒保存。

1.2.3 重組表達載體轉化 參照上海唯地生物技術有限公司的農桿菌GV3101 感受態細胞的使用說明書，將重組表達載體pTRV2－CMV－1a、pTRV2－CMV－2a、pTRV2－CMV－MP 和pTRV2－CMV－CP 轉化農桿菌GV3101 感受態細胞。 將菌液均勻涂抹在LB(含有濃度為25 mg/mL 利福平和50 mg/mL 卡那霉素)固體培養基上，28℃下倒置培養48 h；挑取單菌落經PCR 擴增后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證后分別擴繁。

1.2.4 農桿菌轉化煙草 將pTRV1、pTRV2、pTRV2－CMV－1a、pTRV2－CMV－2a、pTRV2－CMVMP 和pTRV2－CMV－CP 分別接種到LB 液體培養基上，28℃、200 r/min 過夜培養后，調整濃度OD600值為0.8 ～1.0，用pTRV1 分別與pTRV2、pTRV2－CMV－1a、pTRV2－CMV－2a、pTRV2－CMV－MP和pTRV2－CMV－CP 等比混合，離心后棄上清液，將沉淀重懸于等體積的侵染緩沖液(50 mmol/L MgCl2、50 mmol/L MES、0.1 mmol/L 乙酰丁香酮)中。 選取長勢均勻一致的六葉一心煙苗，用1 mL注射器注射侵染液于煙株嫩葉背面，每株煙注射2 片葉，每片葉注射1 mL。

1.3 試驗設計

共設置6 個處理，分別為CK:不注射煙株；空載:注射接種含pTRV2 的侵染液(空載體對照)；C1:注射接種含pTRV2－CMV－1a 的侵染液；C2:注射接種含pTRV2－CMV－2a 的侵染液；C3:注射接種含pTRV2－CMV－MP 的侵染液；C4:注射接種含pTRV2－CMV－CP 的侵染液。 每個處理注射接種20 株煙，每株煙接種2 mL，接種載體后14 d各處理均用金剛砂摩擦接種CMV 病毒。

1.4 測定指標

1.4.1 VIGS 載體接種效果及基因沉默效果的測定 在接種VIGS 載體后10 d，各處理隨機選擇兩株煙，取新長出的葉片，充分消毒后提取RNA，按照表1 中TRV2 擴增引物進行RT－PCR 檢測。在接種病毒后7、14、21 d 時，各處理分別選擇3株煙，取心葉向下第二片葉，充分消毒后提取RNA，反轉錄成cDNA，以煙草26S rRNA 為內參基因，根據GenBank 發布的相關基因序列設計擴增引物(表2)。 按照Quant qRT－PCR kit (SYBR Green，TIANGEN 公司)使用說明在StepOneTMReal－Time PCR 儀(Life technologies 公司)上進行qRT－PCR 檢測。 根據已得到的Ct 值，采用2－ΔΔCt法分析CMV 和TRV 基因的相對表達量。 基因沉默效率(%)計算公式:(對照組CMV 累積量－處理組CMV 累積量)/對照組CMV 累積量×100。

表2 qRT－PCR 所用引物

1.4.2 病毒濃度的測定 在接種病毒后30 d，各處理選擇發病情況一致的3 株煙，取心葉向下第二片葉，液氮速凍后保存于冰箱，使用黃瓜花葉病毒(CMV)酶聯免疫分析試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)測定煙株內CMV 病毒濃度。

1.4.3 發病情況的測定 在接種病毒后第7 天觀察發病情況。 根據《煙草病蟲害分級及調查方法》(GB/T 23222—2008)以株為單位進行病級鑒定，根據下列公式計算發病率、病情指數和防治效果。

發病率(%)＝發病株數/調查總株數×100 ；

病情指數＝(Σ 各級病株數×病級代表值)/(調查總株數×最高病級代表值)×100 ；

防治效果(%)＝(對照病情指數－處理病情指數)/對照病情指數×100 。

1.5 數據分析

采用SPSS 16.0 軟件對數據進行差異顯著性分析(Duncan′s)，采用Microsoft Excel 2007 整理分析數據。

2 結果與分析

2.1 VIGS 載體構建

由圖1 可知，PCR 擴增得到的基因片段大小與表1 一致。 分別將這些基因片段同pTRV2 的線性化載體相連接，獲得對應的表達載體，將測序正確的表達載體轉化農桿菌GV3101 感受態細胞。

圖1 目的基因的PCR 擴增

2.2 VIGS 載體接種效果

以TRV2－F/TRV2－R 為引物，進行RT－PCR檢測(圖2)，產物大小約為744 bp，說明VIGS 載體成功導入煙株。

圖2 VIGS 載體接種煙株后的RT－PCR 檢測

2.3 基因沉默效果分析

從圖3 可以看出，空載體處理的CMV 相對表達量在接種病毒后7 d 和21 d 與對照相比有一定程度的降低。 接種病毒7 d 后，C2 處理的CMV相對表達量最低，基因沉默效率最高，為46.25%；接種病毒14 d 后，空載體處理的病毒相對表達量較對照有一定程度的升高，C2 和C3 處理的病毒相對表達量均顯著低于對照，基因沉默效率分別為39.38%和26.24%；接種病毒21 d 后，接種載體的處理CMV 相對表達量均顯著低于對照和空載體處理，C2 處理基因沉默效率仍最高，為36.8%，C4 處理次之。

圖3 接種病毒后CMV 相對表達量

從圖4 可以看出，TRV 相對表達量不同處理間差異顯著，C2 處理的TRV 表達量顯著高于空載體處理，C4 次之，C1 最少。

圖4 接種病毒后TRV 相對表達量

2.4 基因沉默后病毒濃度

接種病毒30 d 后，各處理CMV 濃度表現出與CMV 相對表達量相似的變化趨勢，C2、C3、C4處理的CMV 濃度均顯著低于對照和空載體處理。其中C2 處理的病毒濃度最低，僅為對照的72.8%；C4 次之，病毒濃度為對照的86.5%；C3 處理為對照的91.3%(圖5)。

圖5 接種病毒后30 d CMV 濃度變化

2.5 基因沉默后抗病效果分析

由表3 可知，發病初期C2 處理的發病率、病情指數最低，防治效果最好；C4 處理次之；空載體的發病情況略輕于對照。 發病高峰期，除C2 處理發病率為95%外，其它處理的發病率均為100%，C2 的病情指數最低，防治效果最好。

表3 不同處理的發病情況

3 討論

Waterhouse 等[24]將馬鈴薯Y 病毒蛋白酶基因片段轉入煙草中，獲得抗馬鈴薯Y 病毒的轉基因煙草。 程英豪等[25]將黃瓜花葉病毒(CMV)外殼蛋白轉入煙草，獲得的轉基因煙草對CMV 抗性增強。 目前煙草的大多數抗病毒研究都是通過將病毒的外殼蛋白基因導入煙草來提高抗性[26，27]，該過程會產生病毒蛋白，因此其安全性存在爭議[28]。 病毒誘導的基因沉默(VIGS)屬于轉錄后水平的基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)，利用植物固有的RNA 干擾和病毒免疫應答機制[29]，避免了翻譯為蛋白的安全性問題。 目前VIGS 技術已成功應用到病蟲害防治中，也被稱為寄主誘導的基因沉默(host－induced gene silencing，HIGS)。 Nowara 等[30]首次發現，將病原體基因導入病毒載體并感染寄主植物后，寄主植物細胞中會產生dsRNA，并在病原體感染寄主時進入病原體中，從而引發病原體發生PTGS。前人將線蟲基因片段導入TRV 載體后侵染擬南芥，成功抑制了根部寄生線蟲體內目標基因的表達[31]。

基因沉默的關鍵是找到起關鍵作用的靶標基因。 CMV 的1a 和2a 蛋白共同組成RNA 聚合酶，并與寄主因子結合形成復合物，在病毒的復制中起作用[32]。 位于胞間連絲的胞間運動蛋白(MP)參與了CMV 的胞間運轉和系統運轉[33]。 外殼蛋白(CP)是一個多功能蛋白，其主要功能是組裝病毒，此外該蛋白還是關鍵的致病因子，參與復制、翻譯、運動、蚜傳等多個過程[34]。 由于CMV 在不同作物中起關鍵作用的基因不同，因此本研究分別在CMV 的4 個關鍵蛋白上構建VIGS 載體。

本研究建立的VIGS 體系中CMV－2a(C2)的基因沉默效果最好，接種病毒后7 d 基因沉默效率最高，病毒累積量最低。 這與前人的研究結果相似:將CMV 的2a 基因轉化入煙草，獲得的煙草植株發病率降低，發病時間推遲[35]。 此外，空載體處理的CMV 累積量與對照相比也有所下降，接種病毒后21 d 達到顯著性差異。 前人研究認為病毒是植物的應激因素，推測接種空載體后引起了植物一系列的防御反應[36]，抑制了CMV 病毒在煙株內的傳播。 接種病毒30 d 后，C2 處理的CMV 病毒濃度最低，即CMV－2a VIGS 載體對CMV 的抑制作用最好，且TRV 載體的含量在各處理中最高。 C2 處理發病初期的發病率最低，僅為對照的40%，發病時間推遲，有效抑制了CMV在煙株內的傳播。

通過VIGS 技術沉默CMV－2a 基因可以很好地防治煙草黃瓜花葉病，下一步將進行大規模田間試驗，為后期大田應用提供理論基礎。 VIGS 技術具有成本低、方法操作簡單等優點[37]，并且對植物無傷害，對環境無污染，是一種具有較好應用前景的方法。 然而溫度是限制VIGS 技術應用的主要因素[38]，因此開發出耐高溫的載體是VIGS技術未來需要努力的重點和方向。

4 結論

本研究建立的CMV－2a VIGS 體系能夠有效沉默外源侵入的CMV 基因的表達，基因沉默效率高達46.25%，有效抑制了CMV 在煙株內的傳播，發病時間推遲，防治效果最好，為防治煙草黃瓜花葉病毒病提供了新的思路與方法。